原代细胞培养实验注意事项详解

　　（1）原代培养材料的选择，尽量选取繁殖能力较强的组织，如胚胎、幼小的生物体或者肿瘤组织等。

　　（2）要注意无菌操作。其操作要求应高于外科手术

　　（3）整个取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇时间1min左右，不能过长，以确保胚胎细胞活性。

　　（4）运用消化法时胰酶温度应低于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。因为此过程不像消化培养细胞时的1~10min，而是至少20min，先消化下来的细胞在此胰酶消化液中继续消化了10min以上。所以胰酶不能作用过强，否则这些细胞易被损伤而不易生存。

　　（5）如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能黏附于瓶壁时再使之与培养液接触，匆使组织块漂浮起来。如果组织块没有黏壁，则细胞不易生长，即使生长也因没有贴在瓶壁上，从而因不能观察到而无法收集到生长的细胞。

　　（6）原代培养操作时，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗涤子宫、胚胎或组织块等。

　　（7）本实验也可以使用新生乳鼠做培养材料。此时要将乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮肤充分消毒，由于乳鼠原代培养污染概率更高，故应小心操作，避免污染细菌。乳鼠原代培养细胞的存活率不及胚胎细胞培养的成功率。

原代细胞培养的实验过程

　　原代细胞(primary cell)：是指从机体的组织(如人组织、小鼠组织、大鼠组织和兔组织等)经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。

　　在我们的科学研究过程中，每个涉及到细胞研究的研究者都会根据自己的实验需求采用不同的细胞。根据自己的课题采用原代细胞或者细胞系，我们都知道，细胞系的培养相对于原代细胞来说更为的简单和易操作，也不会担心细胞在正常条件下会发生分化、衰老等现象从而影响我们实验的可信性和重复性。而原代细胞从获取到培养整个过程要考虑的问题则非常多，接下来我们就具体聊聊吧。

　　一、原代细胞的获取

　　原代细胞的获取，就是从活体上将组织分解成单个细胞再进行培养的过程，且整个过程要求无菌操作。具体要考虑的问题有：组织分解的方式，培养的时间，换液时间，细胞状态判断和冻存。

　　组织分解方式

　　将组织分解成单个细胞的方式目前主要有两种：酶消化法和组织块法（针对贴壁细胞）。

　　【1】酶消化法：所用试剂：胶原酶和胰酶。

　　胶原酶的选择：（根据自己的组织样本选择合适的胶原酶是实验成功的大前提。）

　　胶原酶的配制：建议看相关的文献进行胶原酶的配制。小编常用的是DMEM进行配制，配制好的胶原酶消化液放置在37℃水浴锅内预热（注意现用现配）。

　　胰酶（酶联合法获取原代细胞中会加入胰酶，相关文章也蛮多的）

　　胶原酶消化时间：根据组织特性，消化时间会有差异。以小鼠肾细胞为例，加入胶原酶Ⅰ进行消化后，放入37℃培养箱中消化45min~1h左右，期间每隔10min中震荡一次，知道组织块几乎完全消失为止（若是组织块剪得非常细小，时间可以短一些，30min左右即可）。

　　培养过程：注意原代细胞在培养2天后可能会出现细胞液变黄（橘黄色）的现象，且无漂浮物，这是正常现象哦，不是污染。这是由于细胞在贴壁生长过程中释放了CO2和其他物质导致培养液PH发生了改变，所以变黄。

　　【2】组织块法

　　取材：取组织中间部位，剪成大小均匀的小方块（1~4mm2），清洗干净后转移至培养皿中，在培养皿中各组织块要排列均匀。

　　加液：培养液不能浸没组织块，避免组织漂浮。然后培养4h左右加培养液，培养48h后换液。

　　培养时间

　　无论是酶消化法还是组织块法，取样后培养时间最少需要一周以上的时间，期间可换液或者传代。

　　换液时间

　　无论酶消化法还是组织块法，在培养期间需要随时关注细胞的生长状况，需观察其是否贴壁，是否污染，组织块法要观察是否有细胞迁移出来。正常情况下48~72h可换液一次。

　　细胞状态判断

　　正常贴壁细胞在培养几天后，会逐渐贴满整个瓶底或者皿底，有的呈纤维状，有的呈多边形。下图均为比较健康的原代细胞图（左：小鼠成纤维细胞；右：鸡胚成纤维细胞；下：人成纤维细胞）

　　这些细胞的状态比较好，生长至80%~90%融合就可以传代啦，传代一次后的细胞会更干净漂亮。

　　冻存

　　传一代后的细胞（也可以不传代直接冻存）培养至80%~90%便可冻存起来供后续实验用。

　　冻存液配制：不同的细胞可能会有不同的冻存液配制方案，各实验室也有自己的冻存方案，常见的方案有：

　　A: 10%DMSO+90%的FBS

　　B: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM

　　C: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS (小编常用小鼠的，鹿的都尝试过，细胞状态OK)

　　二、原代细胞的培养

　　原代细胞的培养其实与细胞系的培养无多大差别，针对不同的细胞会选择不同的细胞培养液。

　　1.培养液选择：（根据不同的细胞类型和实验要求进行培养液的选择）

　　最常用的L/H DMEM，F12 DMEM，RPMI 1640。

　　2.细胞培养过程无菌操作。正常的复苏，换液和传代操作，最后将培养好的细胞进行相应的实验即可

　　3.细胞鉴定。有时候我们获取的原代细胞可能会有不是自己期望的细胞在里面，或者获取的不是我们的目标细胞。这个时候我们需要进行细胞的鉴定。细胞鉴定需要购买特定细胞的表面标志物抗体或者染色试剂进行鉴定。如：

　　上图左：为鹿茸间充质层细胞，它可以被甲苯胺蓝染色蓝色，胞质胞核均被染成蓝色。右：为鹿茸软骨层细胞，被甲苯胺蓝染色后胞质胞核均染成紫红色，因其内部富含蛋白多糖，可被异染成紫红色。

　　三、原代细胞试用的实验类型

　　前面我们了解了原代细胞获取和培养过程中应该注意的一些细节，这有助于我们培养我们的原代细胞。那么原代细胞培养好后，它可适用哪些研究呢？

　　原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株（系）研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。在这些应用中几乎都涉及了几个最常见的且最基础的细胞实验，如下：

　　细胞增殖检测：

　　常见检测方法：CCK8检测法 ，MTT检测法，Brdu检测法，Edu检测法，平板克隆形成

　　细胞周期检测

　　常见检测方法：流式检测细胞周期，标记有丝分裂百分率法

　　细胞凋亡检测

　　常见检测方法：流式检测细胞凋亡，线粒体膜电位，活性氧检测，Hoechst染色，电镜，TUNEL

　　细胞转移能力检测

　　常见检测方法：细胞划痕实验，Transwell实验，Invasion实验