MTT实验最全指南详解剖析(mtt实验操作步骤)

2022-04-17 10:36:13

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　　一、MTT是什么

　　MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

　　二、mtt法用来做什么

　　简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。

　　MTT主要有两个用途

　　1、药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定;

　　2、细胞增殖及细胞活性测定。

　　三、为何MTT可以用来做上述工作

　　检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。

　　四、实验所需材料

　　1、MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。

　　市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g

　　1.1、对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。具休做法：预先在50ml离心管(没有的话，可用培养瓶替代)加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。

　　1.2、对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。

　　注意事项：

　　1、在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

　　2、配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感

　　3、MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内(个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。

　　4、MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.

　　2.MTT甲瓒溶解液

　　2.1、二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。

　　2.2、三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液(文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24(10)：455-457)，该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。(个人觉得其溶解的能力不如DMSO强)

　　该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。

　　五、MTT法实验步骤

　　1、胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。

　　细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。

　　对于初学者而言，要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。

　　以一般细胞培养常用的25cm2为例，

　　1)细胞密度在长到约80%~90%(下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态)，消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。

　　2)另取一支新的15ml无菌离心管(为下一步接种96孔板用)，装入约9ml培养基.

　　3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞(见下图);如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。

　　4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以(相当于细胞悬液密度为2×104/ml)，细胞毒性实验每孔5000—10000个(相当于细胞悬液密度为5×104/ml)。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。

　　2、将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。

　　注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。

　　3、将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。下图可做为96孔板的的参考步局。

　　对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。

　　4、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。

　　5、每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

　　6、终止培养，准备溶解结晶。

　　溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解

　　1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。

　　2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

　　另一种方法，用三联溶解液(见上面MTT甲瓒溶解液)

　　1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。(该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。)

　　2) 放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。

　　在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。

　　7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

　　六、MTT结果分析

　　关于如何计算IC50

　　1、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

　　Xm:lg 最大剂量

　　I:lg(最大剂量/相临剂量)

　　P:阳性反应率之和