本文技术干货：

　　1.细胞培养、传代、冻存和复苏步骤。

　　2.污染防治。

　　3.细胞培养常见问题解答。

　　一、

　　培养、传代、冻存和复苏

　　01

　　准备工作：

　　根据培养细胞的特性，提前准备好适合的培养基和血清等。最好沿用细胞原来的培养条件，以免细胞在新环境下还需要过渡适应。同时，充分了解到细胞的生长特性和形态特征，便于后续的培养观察。

　　PS：一般我们这边（广州赛库）提供出去的细胞为方便运输都是灌满培养基，但血清浓度只有5%，以免运输中过度生长，所以收到细胞后记得补加血清。

　　02

　　贴壁细胞传代：

　　1）移弃使用过的细胞培养液。（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染）

　　2）使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，最后移弃冲洗液。（洗去残留的血清，避免影响胰酶的活性。）

　　3）以 25 cm2的培养瓶为例，向瓶内加入1ml胰蛋白酶-EDTA（请根据各细胞的指引使用合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，几分钟内，会发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流下，此时应加入2-3ml含血清的完全培养液终止消化（细胞解离所需时间请参考各细胞的指引，并建议每隔30秒在显微镜下观察细胞的解离情况）。另，并不是所有贴壁细胞都适用采用胰蛋白酶进行解离，请根据各细胞的指引选择合适的解离方法。

　　PS：我们这边（广州赛库）出去的细胞，一般会根据我们的经验备注消化时间和条件，给大家提供参考。

　　4）使培养瓶倾斜，吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面，重复该动作2-3次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应避免气泡的产生）。

　　PS：对于难消化的细胞，尽量不要通过用力吹打的方式来处理，以免对细胞产生物理损伤。可以先将已经消化的细胞分出来，及时终止消化。然后再对仍然贴壁的细胞进行再次消化。做到分层消化，避免易消化细胞长时间在胰酶消化下受损。

　　5）把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后移弃上清。

　　6）加入新的含血清完全培养液重悬成单细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新的含血清完全培养液，轻轻摇晃混匀。

　　7）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的贴壁情况。

　　03

　　悬浮细胞传代：

　　因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。

　　1）直接传代时，静置5-10分钟，待悬浮细胞慢慢沉淀到器皿底部后，吸掉1/2-2/3原培养液，补足新鲜的含血清完全培养液，混匀成细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，轻轻摇晃混匀。

　　2）离心传代时，将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800-1000rpm离心3-5分钟，移弃上清后，加入新鲜的含血清完全培养液重悬。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新鲜的含血清完全培养液，轻轻摇晃混匀。

　　3）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。

　　04

　　贴壁悬浮混合型细胞传代：

　　先将悬浮的细胞收集，再参考“贴壁细胞传代”方法进行消化收集，一起接种到培养器皿中。

　　PS: 悬浮细胞生长中一般对细胞密度要求比较高，培养中最好参考指南控制好细胞密度，不能过密也不能过稀。

　　05

　　细胞冻存：

　　1）按照“细胞传代步骤”中的方法收集细胞。

　　2）加入细胞冻存液（一般10%DMSO+对应细胞的完全培养液），使细胞的终密度为(5~10)×105个/ml，移入细胞冻存管中。

　　3）程序降温（以使用需异丙醇的Nalgene程序降温盒为例）：4℃ 30min→-80℃过夜→液氮。（一定不能省略4℃的30min，否则冻存液无法渗透到细胞，易产生冰晶导致细胞受损。）

　　06

　　细胞复苏：

　　1）取出贮存的细胞，待液氮挥发后，马上37℃水浴中轻轻摇动使快速融化（通常2min内，时间长了细胞状态会受影响）。为避免剧烈的温差变化导致冻存管炸裂，操作该步时请配戴防护面罩或防护目镜。

　　PS：干冰运输的冻存细胞，收到后需要立刻放入深低温冰箱或液氮中，至少3d后再进行复苏操作。

　　2）转移到无菌操作台，75%酒精擦拭冻存管外部。

　　3）将细胞悬液转移到装有10-20ml经预热的含血清完全培养液离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟，移弃上清。

　　4）重新加入经预热的含血清完全培养液重悬细胞，以约(3~5)×105个/ml密度接种到培养器皿中。

　　5）放到37℃孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。

　　二、

　　污染防治

　　01

　　细菌污染

　　细菌污染是细胞培养中最常见的污染，主要由操作不慎或使用了灭菌不完全的耗材与试剂引入。最常见的有枯草杆菌、大肠杆菌、假单胞菌及白色葡萄球菌。镜下形态则为长杆状、短杆状和颗粒状等。

　　左边的就是比较典型的杆菌污染，一般杆菌会延轴向快速游动，量少时培养基澄清。右图是颗粒状污染，一般培养基会浑浊或有白色沙状沉淀。

　　好氧菌增殖分裂迅速，感染24h内即可使培养基浑浊；厌氧菌在常规细胞培养条件下增殖缓慢，需要较长时间才会观察到浑浊现象。

　　污染处理：由于国内细胞培养中抗生素使用泛滥，所以出现污染后加双抗（青霉素&链霉素，Penicillin + Streptomycin）一般没有效果。杆菌可选用100ug/ml庆大霉素处理一周，颗粒状细菌可用25ug/ml环丙沙星处理一周，效果相对还不错。

　　02

　　真菌污染

　　细胞培养中最常见的污染真菌有：烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。

　　左边这张是比较典型的霉菌污染的图片，右图是酵母污染，镜下可以看到明显的出芽形态。

　　污染处理：可用100ug两性霉素B/T25瓶，处理一周。

　　注：两性霉素毒性较大，需要在细胞有50%以上且状态没受大影响前处理。

　　03

　　支原体污染

　　支原体的危害：支原体污染可以改变细胞的特性。例如部分支原体会快速消耗培养液中的精氨酸，与细胞竞争营养，从而使细胞的生长速度减慢或停止；同时支原体还可以改变细胞的酶谱、细胞膜成分，造成细胞染色体异常或细胞病理性改变等。上述情况会严重影响到使用这些细胞所做实验的结果，导致结论不可靠。

（PCR法检测细胞上清中的支原体污染）

　　支原体的预防与清除：由于支原体无法在镜下直接看到，需要通过PCR法等进行检测才发现，出现污染后比较难发现。建议在养细胞每月检测一次并结合每周抽检，做到有污染早发现。对于正在进行支原体去除处理的细胞建议每周必检，直至出现阴性结果并至少维持一月。不同的细胞分开处理，优先处理“支原体阴性”细胞，后处理正在做去除处理的和受感染的细胞。同时，新引进的细胞系都进行支原体检测，确保不给实验室带来新的污染。

　　04

　　实验室细胞污染防治

　　建立良好的规章制度对减少细胞污染会有很大的帮助。包括准入制度、操作规范和日常管理制度。

　　准入制度：包括了人员的和物料的。人员需要进行培训之后才能自己进行操作，而且要符合穿戴要求才能进实验室，如白大褂、隔离服，口罩，手套等。而所需用到的物品，非一次性的物品应严格消毒灭菌，而购买的物品需要从正规的、可靠的渠道购买。新买的细胞应检测验证后再使用。

　　操作规范：对于常规操作最好制定规范，且实验室人员都要按操作规范进行，不能随意更改，同时也是培养实验人员的良好操作习惯。比如，枪头滴管吸完就不再二次伸入培养基中吸取，一次吸够足够量的培养基。加液时也应尽量做到悬空加液，这些都可有效预防支原体污染和细胞交叉污染。另外可以的话，一次只操作一株细胞，细胞与细胞间最好有一点时间间隔，避免交叉污染。

　　日常管理制度：则包括环境及耗材试剂等的使用、清洁、保养等各方面的规则、方法。还有试剂耗材等的用量、库存及采购等的管理，包括细胞样品的两级库存管理。对于不易发现的污染源，最好定期进行检测，主要是支原体污染和细胞交叉污染。

　　三、

　　细胞培养常见问题汇总

　　Q：培养液到底要不要加双抗（青霉素&链霉素，Penicillin + Streptomycin）？

　　A：双抗不是细胞生长必需的。我们培养细胞时不常规使用抗生素，因为连续使用抗生素会促进抗生素耐药性细胞株的产生，导致轻度污染持续存在。一旦将抗生素从培养液中去除，这种轻度污染最终将发展成大规模污染。

　　请根据各自实验室的环境情况，自行决定是否使用双抗。

　　Q：能更换成其它种类的培养液吗？

　　A：我们强烈建议使用细胞提供机构或细胞库推荐的生长培养液。另，有些细胞可能适合在不同培养液里生长，在做好保种或有细胞维持在原推荐培养条件下，可分出部分细胞做测试。

　　Q：细胞在培养过程中出现碎片如何处理？

　　A：贴壁细胞在移除原培养液后，用PBS液冲洗2-3遍；悬浮细胞离心移除原培养液后，加入PBS重悬，离心移除PBS；一般建议重复上述步骤2-3遍，800-1000rpm离心3-5分钟。

　　Q：细胞能放在-80℃保存吗？

　　A：长期保存的细胞应在液氮（-196℃）存放，短时间（一般1-2周）可以存放在-80℃。

　　Q：培养瓶是用密闭盖好，还是透气盖好？

　　A：都可以。只是在使用密闭盖培养瓶时，瓶盖旋进约2/3，预留约1/3以便细胞进行气体交换；或部分品牌的密闭盖培养瓶的瓶盖上有合适位置指示标志。

　　Q：L-15培养基不需要二氧化碳培养，怎样处理？

　　A：在没有独立培养箱情况下，可选用密闭盖培养瓶，拎紧瓶盖培养。