自1990年萤光素酶生物传感器技术诞生以来，单萤光素酶检测系统到双萤光素酶检测系统的发展，为科研人员提供了更为严谨的实验手段。双萤光素酶报告基因检测系统在单报告基因的基础上引入了“内参对照”报告基因，可以排除不同组之间细胞生长状况、细胞数目以及转染效率带来的干扰，起到校正的作用，从而使实验结果更为可靠。今天小翌将从双萤光素酶报告基因检测系统的原理与应用开篇，给大家分享双萤光素酶报告基因检测系统的实验操作流程。

　　双萤光素酶报告基因检测系统原理

　　萤火虫萤光素酶是一种胞内蛋白，大小为61KDa。在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下，催化底物萤火虫萤光素氧化，生成氧化萤光素，并发出黄绿色光，其最强发光波长为560nm。

　　海肾萤光素酶也是一种胞内蛋白，大小为36KDa。只需要氧气就可以催化腔肠素，氧化生成高能产物coelenteramide，并发出蓝光，其最强发光波长为465nm。

　　双萤光素酶报告基因检测系统应用

　　◆ microRNA研究

　　在报告基因的3'端加上目的基因的3'UTR，就能用来检测miRNA对于目的基因的调控（抑制作用），报告基因表达越少，说明miRNA的作用就越强。

　　◆ 转录调控研究

　　在报告基因的5'端加上待检测基因的启动子，就可以用来检测转录因子对启动子的作用，启动转录越多，那报告基因的表达量就越大，荧光值越高。

　　◆ 启动子研究

　　将启动子区域序列进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建到luciferase报告载体中，检测其启动子活性。

　　◆ 信号通路研究

　　信号通路的激活/监测基因的表达水平。

　　双萤光素酶报告基因检测实验操作流程

　　报告基因检测流程主要有4个模块：分别是质粒构建、细胞转染、报告基因检测和数据分析。

　　质粒构建

　　双萤光素酶报告基因系统一般将萤火虫萤光素酶报告基因质粒和海肾萤光素酶报告基因质粒共转染细胞，或将这两个报告基因构建到同一个骨架质粒上（如pGL4质粒），分别用不同的启动子启动其表达。

　　◆ 主报告基因载体的选择

　　根据实验目的选择对应的载体骨架。

　　如果是基因调控研究，需要选择不带启动子或其他调控元件的骨架载体。如果研究启动子强弱或转录因子对启动子的作用，那么就在该萤光素酶的5'端加上待检测启动子序列或者有转录因子结合位点的启动子（下图左）。如果想检测miRNA对于目的基因的抑制作用，就可以在萤光素酶3'端加上目的基因的3'UTR（下图右）。

　　◆ 内参报告基因载体的选择

　　带有表达组成型启动子的萤光素酶表达载体作为内参。

　　不同的载体带有的启动子不同，通常启力：CMV＞SV40＞PGK＞TK。通常内参基因表达的活性应当显著的高于背景组，同时，尽量小，确保不干扰主报告基因的表达。所以一般选择内参载体时，首先考虑活性较弱的TK启动子载体，如果表达量过低，再考虑其他类型的启动子或者构建自己需要特殊的启子。