免疫组化，即免疫组织化学技术，是一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位、定性的实验技术。

　　操作步骤

　　01

　　切片：

　　包埋好的蜡块用切片机进行切片

　　将切成的蜡带平铺在水浴锅中

　　等待切片完全展开后有防脱载玻片轻轻将切片捞起，使其贴在载玻片上

　　将载玻片放在切片架上

　　02

　　烘片：70℃烘片30-40min

　　03

　　脱蜡水化：将切片依次浸入以下溶液

　　二甲苯Ⅰ15min

　　二甲苯Ⅱ15min

　　无水乙醇5min

　　90%乙醇3min

　　80%乙醇3min

　　70%乙醇3min

　　蒸馏水3min*3次

　　PBS 3min*3次

　　04

　　阻断内源性过氧化物酶：

　　将3%过氧化氢倒入染色缸

　　将切片放入染色缸中

　　避光孵育20min

　　将切片浸泡于PBS 3min*3次

　　05

　　抗原修复：

　　将柠檬酸钠稀释50倍

　　将10mL的50x缓冲液中加入到1L的烧杯中，再加入490mL的蒸馏水，玻璃棒搅拌均匀

　　用微波炉煮沸

　　将组织切片放入烧杯中

　　调至中火（P50），保温20min

　　修复结束后，将烧杯拿出，烧杯和切片一同室温冷却至室温（注：不要将切片从烧杯中拿出）

　　PBS 3min*3次

　　06

　　封闭：

　　用吸水纸将组织周围的水小心吸干净

　　用免疫组化笔在组织周围画圈以防止后续抗体流出

　　在圈中滴加5%山羊血清封闭液至覆盖组织

　　将切片平放于湿盒中，室温孵育30min

　　07

　　一抗孵育：

　　甩掉封闭液，滴加一抗使其覆盖组织

　　放入湿盒中，4℃孵育过夜

　　08

　　清洗：

　　第二天取出湿盒后，室温复温30min

　　回收一抗

　　将切片依次浸入PBS 3min*3次，蒸馏水5min*2次

　　09

　　二抗孵育：

　　切片甩干水分并吸走水珠

　　滴加二抗使其覆盖组织

　　室温孵育120min或4℃孵育过夜

　　10

　　DAB显色：

　　将二抗回收至干净的1.5mL的离心管中

　　用PBS浸洗切片3min*3次

　　甩去多余的PBS

　　在切片上滴加DAB显色液

　　观察切片染色情况，棕黄色为阳性，染色明显即可用蒸馏水冲洗玻片终止显色

　　11

　　复染细胞核：将切片置于苏木素中复染2min，细胞核变蓝色即可终止，并用自来水冲洗

　　12

　　分化：将切片置于1%盐酸乙醇中分化5s，使组织由蓝色变成棕黄色，然后自来水冲洗3min

　　13

　　脱水：将切片依次浸入以下溶液

　　70%乙醇1min

　　80%乙醇1min

　　95%乙醇2min

　　100%乙醇4min

　　14

　　封片：切片铺平晾干后，滴加适量中性树胶封片