今天要给大家讲解的是细胞表型实验中，

　　细胞迁移侵袭能力常用到的检测手段

　　细胞迁移（cell migration）是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。细胞迁移是正常细胞的基本功能之一，是机体正常生长发育的生理过程，也是活细胞普遍存在的一种运动形式。胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫反应、炎症反应、动脉粥样硬化、癌症转移等过程中都涉及细胞迁移。和增殖能力同理，正常具备迁移能力的细胞，受到损伤病变后，迁移能力会被削弱；而肿瘤细胞的迁移能力普遍会比较强。

　　细胞侵袭（cell invasion）则是主要指代肿瘤细胞的一种恶性行为（听名字是不是就比较凶残……）。上面说的迁移也就是在没有阻力，受到趋性招募的情况下细胞的移动。但侵袭，是指细胞要裂解销蚀掉“阻力”（如细胞外基质）实现移动的能力。肿瘤细胞的侵袭能力，也就直接对应了临床上肿瘤的浸润和转移。

　　一、细胞划痕实验

　　划痕实验在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程。价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。与包括活细胞成像在内的显微镜系统兼容，可用于分析细胞间的相互作用，是研究细胞迁移体外实验中最简单的方法。

　　那么划痕实验的原理是什么呢？

　　划痕实验简单来说，就是当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合，以此判断细胞的生长迁移能力。是不是很简单。

　　那么告诉你一个更开心的事，划痕实验的实验步骤同样很简单。不信你看~

　　具体实验流程如下：

　　1) 铺板：处于对数生长期的细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种于6孔培养板；细胞铺板6*105个细胞/孔，确保第二天细胞能够长满，每孔最终的培养基总量2mL；

　　2) 细胞培养：37℃、5％CO2培养箱中培养24h，

　　3) 划痕:第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜(不同孔之间最好使用同一只枪头)，每孔划三道；

　　4) 清洗：PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基；

　　5) 拍照：4倍镜下进行拍照，保证划痕居中且垂直，注意背景一致，可按0，6，12，24h时间点取样，拍照(具体时间依实验需要而定）；

　　6) 数据分析

　　虽然划痕实验的原理和操作都比较简单，但划痕实验仍旧有一些要点需要注意：

　　1) 首先，划痕法测量适用的细胞范围较小，一般只适用于上皮细胞，纤维样细胞。因为这些细胞本身有迁移能力，且较强。而且细胞有极性，方便测量，观察。

　　2) 然后，实验时应注意细胞生长状况，选择适当细胞接种浓度，对不同细胞要观察细胞贴壁率等，确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度合适。

　　3) 最重要的是，一般做划痕实验，都是无血清或者低血清否则细胞增殖就不能忽略。

　　二、 Transwell检测迁移/侵袭能力

　　划痕实验是不是看着十分的物美价廉？不过有么有发现，划痕实验虽然能够检测细胞的迁移能力，但是好像和检测细胞的侵袭能力么得啥子关系？

　　所以第二个要给大家分享的是transwell检测。既能检测迁移能力，又能检测侵袭能力。做过transwell的小伙伴或许都知道这个词是可以拆解成trans＋well的。所谓trans即转运，转移，穿过的意思，而well则为小室，小皿的意思。字面上理解就是说使物质通过小室转移。

　　它可以做：

　　①细胞共培养：研究某一细胞分泌产物对另一细胞迁移的影响；

　　②趋化实验：研究某药物/蛋白/激素等对细胞迁移的影响；

　　③细胞迁移实验：研究细胞的迁移能力；

　　④ 肿瘤细胞侵袭实验：研究肿瘤细胞的侵袭能力（这里需要加入Matrigel，模拟体内细胞外基质等阻力环境）。

　　了解完实验的用途，那接下来又到了我们的实验流程教学时间。

　　具体步骤如下：

　　1) 首先，细胞处理：处于对数生长期的细胞，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，(用PBS洗1-2遍)，用无血清培养基重悬；

　　2) 铺板：24孔板下加入600ul含10%FBS的培养基，取细胞悬液150μl 加入Transwell小室，每孔10000个细胞；

　　3) 细胞培养：37℃、5％CO2培养箱中培养20~24h；

　　4) 固定：取出Transwell小室，弃去孔中培养液、用无钙的PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30分钟甚至过夜；

　　5) 染色：0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。100倍显微镜下拍照；

　　6) 拍照：100倍显微镜下，最多选取五个非重复视野进行拍照，并且进行计数

　　而对于侵袭实验来说，最大的区别就是在细胞种板前增加了一个基质胶包被的操作。我们再来看一遍~

　　最后给大家讲解一下实验的注意事项，细节决定成败。

　　1) 选择合适直径和孔径，一般有0.3um(用于细胞间接共培养), 4um（用于血细胞分析）,8um（用于肿瘤细胞和其他组织细胞分析））的Transwell；

　　2) 选择合适的培养细胞时间：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞迁移侵袭能力力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视，要在。

　　3) 细胞铺板要均匀，如果接种不均匀，后面无法用软件对图片进行细胞计数；

　　4) 下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

　　5) 另外，做侵袭实验需特别注意，基质胶在过高或过低的温度均易凝固，因此操作所需枪头和离心管应提前在4℃预冷；铺胶时保证液面水平，胶的厚度要均匀一致，切勿产生气泡。