miRNA、lncRNA 和 circRNA 已成为研究的大热门，也是近年来国自然申请标书中的香饽饽。这两个非编码RNA家族的重要成员以多种方式调节生命活动，包括转录调节、转录后调节、翻译调节、蛋白质定位等。对其功能和机制的系统研究有助于我们更全面、更深入地理解基因表达调控机制和生物的生命活动。但是该如何进行miRNA、lncRNA 和 circRNA 研究呢?Bybiotech整理了一些科研大咖们的经验之谈，供大家参考!

　　关于miRNA、lncRNA、circRNA的研究，基本脱离不了以下几步：

　　1、初步小样本测序或者芯片或者panel，这个筛选，当然，一般还会伴随mRNA的差异筛选

　　2、大样本PCR验证

　　3、功能研究(细胞和动物模型)

　　第一步，基本就是文章的基础，也是烧钱阶段;而这一步一般还需要生物信息学技术支持，尤其是Gene Ontology和KEGG，已经其他各种预测软件等，如mirbase，circbase，lncRbase，starbase等，这些软件，前前后后估计差不多上百个了，不需要会太多，搞懂一两个基本就可以了;还有个软件Cytoscape，这个功能强大，学会了不得了。

　　第二步，大样本PCR验证，这个基本就是现在好多实验的终点，基本很多都是在这一步后就发文章了;很多就是发现一个ncRNA可以作为biomarker或者差异表达，基本都是5分以下文章;

　　第三部，基本都先是靶基因预测和验证，然后看是否有增殖、凋亡、再生和调控某些信号通路之类，然后进行转基因验证。这一步也是烧钱地方，也是技术含量最高的地方，一系列基本实验：WB/IHC/PCR/IF/转染等全是在这里烧钱和花时间，各种mimic、inhibitor和转基因小鼠。但是这一系列下来，文章水平自然不差。

　　最近见得比较厉害也比较省时间的就是下面几种：

　　1、circRNA测序or芯片，circRNA毕竟还比较新，靠这个发文章这两年不少;

　　2、circRNA测序or芯片加上简单功能验证，加上增殖、凋亡等功能，现在的主要方向;

　　3、circRNA测序or芯片加上mRNA差异表达;

　　4、circRNA or lncRNA测序or芯片，然后找出其互相作用的miRNA，从miRNA方面进行功能解释和验证;

　　5、circRNA测序or芯片加上lncRNA测序or芯片，进行组合测序，筛选差异表达circRNA、lncRNA、mRNA，然后进行生物信息学分析，筛选Gene Ontology和KEGG功能和信号通路;or进行靶基因预测和验证;还有对筛选差异表达circRNA、lncRNA、mRNA进行可能结合miRNA，从miRNA方面进行功能解释和验证，毕竟miRNA功能验证已经成熟和经典，而且存在sponge这个东西，可以互相作用;

　　6、circRNA测序or芯片加上lncRNA测序or芯片再加miRNA测序or芯片再再加mRNA差异表达筛选。

　　这样说可能比较含糊，来几个案例：

　　1、单独ncRNA和功能研究，miRNA的很多了，来一个circRNA的与miRNA一个套路，先芯片，然后筛选差异表达，然后简单功能验证。

　　2、circRNA or lncRNA测序or芯片，然后找出其互相作用的miRNA，从miRNA方面进行功能解释和验证。

　　3、circRNA测序or芯片加上lncRNA测序or芯片，进行组合测序，筛选差异表达circRNA、lncRNA、mRNA，然后进行生物信息学分析，筛选Gene Ontology和KEGG功能和信号通路;

　　第一步：筛选差异表达circRNA、lncRNA、mRNA

　　第二步：简单验证

　　第三步：Gene Ontology和KEGG、调控网络构建

　　circRNA、lncRNA、miRNA等调控性ncRNA可通过与protein、RNA或DNA分子互作，发挥其多样化的调控功能。如何搞定调控性ncRNA研究方案？

　　第一步确定ncRNA研究目标

　　一般可通过以下三种方法，确定研究目标：（1）通过查阅文献，寻找线索，嫁接研究对象，照猫画虎；（2）通过生物信息学，分析挖掘GEO、TCGA等数据库相关数据，发现潜在研究目标；（3）通过RNA测序、基因芯片等高通量筛查，获得大量一手原创数据，从中自由选择研究目标。

　　第二步快速论证ncRNA调控功能

　　一般在细胞水平，通过gain/loss of function干预第一步确定的ncRNA，使用Western Blot等方法检测所关注生物学过程（如自噬、凋亡、增殖、迁移等）的相关marker，论证ncRNA的调控功能。

　　第三步揭示ncRNA调控作用的分子机制

　　首先，确定ncRNA的亚细胞定位。然后，通过targetscan、catrapid、RNAhybrid、lncbase等生物信息学分析工具，预测与ncRNA互作的RNA、protein或DNA；或者，通过gain/loss of function干预ncRNA，再进行RNA测序、基因芯片或蛋白质质谱，筛查ncRNA调控的靶分子。继而，采用RNA pull down、RIP、ChIP、ChIRP、EMSA、Reporter gene assay等技术，论证ncRNA-protein、ncRNA-RNA或ncRNA-DNA互作关系。