二十世纪七十年代，Friedenstein首次从骨髓中分离出一种多能基质细胞，呈梭形，可以进行体外克隆和多向分化，被称为CFU－Fs(colony－formingunitfibro-blasts)。随后，这种骨髓来源的基质细胞被进一步发现是间叶组织细胞谱系的共同前体细胞，因其具有干细胞的部分特性，而被命名为骨髓间充质干细胞(BMSCs)。

　　BMSCs来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，免疫原性低。但是不同的分离培养方法使得BMSCs在体外扩增时的纯度、活性、表型和分化潜能差异很大，导致基础研究结论各异和临床试验效果不一。因此，深入认识BMSCs不同分离方法和培养条件的优缺点，并根据实验目的做出相应选择，是进行BMSCs实验研究的关键环节。

　　目前用于分离BMSCs的方法主要有五种，分别是贴壁筛选法、骨组织消化法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和磁珠分选法。下面就来教大家如何掌握这五种分离方法。

　　01  贴壁筛选法

　　贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同，逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的方法，常用于干细胞的培养中，因此用于分离BMSCs最为广泛。

　　利用BMSCs贴壁生长特性，更换培养液逐步去除漂浮生长的造血系统细胞即可获得较纯化的BMSCs；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质,可促进BMSCs贴壁生长，贴壁筛选法也常被称为直接培养法或者全骨髓法。

　　操作步骤

　　01  以颈椎脱臼法处死SPF级3-4周龄C57BL/6J小鼠或者SD/Wistar大鼠，用75%乙醇浸泡。

　　02  随后在鼠的腿的位置剪开外皮和内皮，无菌状态下取出双侧股骨和胫骨，浸泡于无菌含双抗PBS溶液中。剔除股骨和胫骨周围的肌肉、结缔组织（图1-1），用含双抗的PBS溶液清洗三遍。

　　03  用眼科剪剪去股骨和胫骨的两端，暴露骨髓腔（图1-2）。

　　04  用注射器以完全培养基反复冲洗骨髓腔直至骨头发白（图1-3）。

　　05  收集骨髓液（图1-4），离心（图1-5），后加入适当培养基（含20%血清）（图1-6）接种于培养基皿（图1-7）中置于37℃，5％ CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养（图1-8）。

　　06  24-48h后去悬浮，接下来的每3天换液一次，直到需要传代。

图1 贴壁筛选法分离提取BMSCs

　　对初次培养者来说，贴壁法分离BMSCs操作简单易掌握，不易发生污染，是一个较好的分离方法。不足的是分离提取的细胞纯度相对不高。

　　02  骨组织消化法

　　骨组织消化法操作简单、成本低，且获得的BMSCs纯度较贴壁筛选法高，是分离BMSCs较为常用的方法。

　　操作步骤

　　01  参照贴壁筛选法上述操作步骤第1-3步，收集冲去骨髓的股/胫骨于无菌的培养皿中，用无菌眼科剪小心地将骨组织剪成约1～3mm3的碎片。

　　02 之后加入适量含1mg/mL Ⅱ型胶原酶的新鲜完全培养基（含5% FBS），于37℃摇床中振荡消化 。

　　03  消化结束后离心，弃上清液，用PBS清洗两次，然后将骨碎片接种于培养皿中，加入适量新鲜的完全培养基（含20% FBS）淹没骨碎片，并置于37℃ 5%二氧化碳培养箱中培养。

　　04  培养至72h后进行首次半量换液。此后每3天换一次液。待贴壁细胞达到80%~90%融合，进行细胞扩增传代。

　　使用骨组织消化法分离BMSCs也并非完美，II型胶原酶的消化可能影响BMSCs活性及增殖能力。

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