实验外包：酶联免疫吸附测定实验流程

2021-10-12 03:48:01

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　　ELISA(酶联免疫吸附测定)是一种利用抗体/抗原反应和最终的颜色变化来检测物质含量的检测方法。ELISA试剂盒(ELISA Kits)已成为药物和植物病理学研究中的常用诊断工具，也是很多行业重要的质量控制手段。ELISA试剂盒是检测组织提取液、血清和细胞培养液中目标抗体/抗原的理想工具。

　　酶联免疫吸附作用

　　(1)免疫酶染色各种细胞内成份的定位；

　　(2)研究抗酶抗体的合成；

　　(3)显现微量的免疫沉淀反应；

　　(4)定量检测体液中抗原或抗体成份。

　　本文以检测待测标本中肿瘤坏死因子TNFα的含量介绍双抗体夹心ELISA 法。其基本原理是：抗人TNFα单克隆抗体被固相化在酶标板上，所加入标本中的抗原TNFα被酶标板上的单克隆抗体所捕获，通过洗涤以去除多余的或结合不牢固的抗原;被捕获的TNFα再与加入的生物素化的抗人TNFα二抗结合，通过洗涤以去除多余的或结合不牢固的二抗;生物素再与加入的亲和素-HRP结合，通过洗涤以去除多余的或结合不牢固的亲和素-HRP，HRP与最后加入的底物反应，形成有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

　　实验前准备

　　1、实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材：

　　TNFα的ELISA检测试剂盒为：Human Tumor Necrosis Factor α ELISA Kit。此试剂盒中包含了实验所需的所有主要试剂。

　　2、主要仪器和耗材有：

　　Thermo Scientific 全波长扫描式多功能读数仪、芬兰百得的各个量程单通道移液器，赛默飞公司的QSP盒装吸头及冰盒等。

　　实验流程

　　本实验操作流程是：样品的稀释;样品与捕获抗体的孵育;洗涤;二抗孵育;洗涤;亲和素-HRP 孵育;洗涤;底物显色;OD 值的检测;标准曲线的绘制与标本中 TNFα 浓度的计算。

　　1、样品稀释

　　(1)预先将冻干的人 TNFα 标准品溶解在适量超纯水中，溶解成浓度为2000pg/ml 母液。

　　(2)取8只1.5ml离心管，做好浓度标记，分别是：1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、0pg/ml。分别吸取200μl的样品稀释液至8个离心管中，取200μl的标准品母液至第1个离心管中，漩涡混匀后吸取200μl至第2个离心管中，同样漩涡混匀后吸取200μl至第3个离心管中，依次稀释至第7个离心管，最后一个标记为零的离心管不含标准品，作为空白对照。

　　2、免疫反应

　　(1)实验中所用到的试剂均需预先从冰箱中取出，室温恢复至常温。

　　(2)按每孔50μl往已包被了人TNFα单抗的酶标板中加入各组样品，每组样品2至3个复孔，首先加入1个空白对照样、然后是7个浓度的标准品、最后是两个稀释倍数的待测样品。加完后轻轻拍打酶标板数次混匀。注意：标准品按浓度梯度依次加样，并且做好各个样品的标记。

　　(3)用盖板膜小心盖好酶标板，确保所有的边缘已密封好，室温孵育 1h。

　　(4)孵育结束后，小心去除板盖膜，吸去板内液体，用 Plate Washing 洗涤酶标板 3 次，将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。

　　(5)按每孔100μl加入已稀释好的生物素标记TNFα二抗。

　　(6)盖板膜小心盖好酶标板，确保所有的边缘已密封好，室温孵育 1h。

　　(7)孵育结束后，小心去除板盖膜，吸去板内液体，用 Plate Washing 洗涤酶标板 3 次。将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。

　　(8)按每孔 100μl 加入亲和素-HRP，盖板膜小心盖好酶标板，室温避光孵育30min。

　　(9)孵育结束后，小心去除板盖膜，去除板内液体，用 Plate Washing 洗涤酶标板 3 次。将整个酶标板倒置在吸水纸上，轻轻拍板以去除残余液体。

　　(10)按每孔 100μl 加入 TMB 显色底物，室温避光反应 30min。

　　(11)30min后，每孔加入100μl Stop Solution终止反应，终止后孔内液体呈现橙黄色。