质粒提取目的：质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或者表达的重要媒介，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，要想从细中获得质粒DNA,需要通过质粒提取的方法。

　　质粒提取的方法

　　质粒提取主要有碱裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。

　　1、碱裂解法原理：根据共价闭合环状DNA与线性DNA的拓扑学结构差异来分离的。在强碱环境下，细菌的细胞壁和细胞膜被破坏，基因组DNA和质粒DNA被释放出来，线性DNA双螺旋结构被破坏而发生变性。虽然在强碱的条件下共价闭合环状质粒DNA也会发生变性，但两条互补链仍会互相盘绕，并紧密的结合在一起。当加入pH4.8的乙醋酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。

　　2、煮沸法裂解：将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA。煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制备），多至250mL（大量制备）菌液的质粒，并且对大多数的大肠杆菌菌株都适用。

　　3、小量一步提取法：由于细菌染色体DNA比质粒大得多,受机械力后细菌染色体DNA会被震断成不同大小的线性片段而缠绕附着在细胞碎片上，并发生变性。同样受机械力质粒DNA会变性，机械力消失后复性。但质粒DNA的复性快，仍溶于溶液而细菌染色体DNA复性较慢，会形成不溶的网状结构，通过高速离心可以分离得到质粒DNA 。

　　质粒提取方法选择

　　质粒提取的方法主要根据质粒DNA分子量的大小，所用细菌的种属，细菌裂解释放DNA后的纯化方法和实验要求来选择。

　　1、质粒DNA的分子大于15kb时，在质粒抽提过程中容易受损，可以采用比较温和的裂解方法，将细菌悬浮于等渗的葡萄糖溶液中，加入溶菌酶和EDTA破坏细胞壁和细胞膜，这样可以缓解高渗透压的细菌在释放质粒DNA时的压力，保护质粒DNA。

　　2、小分子的质粒DNA可以选用相对剧烈的方法来分离DNA。可以用煮沸法，碱裂解法或者加入溶菌酶，EDTA和去垢剂裂解细菌。这些方法会使DNA变性，但两条互补链仍会互相盘绕，并紧密的结合在一起，在恢复正常条件后，DNA便会复性。

　　3、对于那些经变性剂、溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株，则不推荐使用煮沸法。而这些碳水化合物在密度梯度中会紧靠超螺旋的DNA分子形成致密模糊的区带，因此很难避免，而这些碳水化合物可抑制多种限制酶的活性。这类菌株制备质粒时，不宜采用煮沸法。

　　4、菌株含有限制性核酸内切酶A的不宜使用煮沸法。因为煮沸不能使内切酶A完全失活，在后续实验中再用限制性内切酶消化时，质粒DNA会被降解。此时必须用酚：氯仿进行抽提。

　　煮沸法时间短，（特点） 操作简单，时间短；（缺点）条件过于剧烈，易造成质粒断裂，回收率较低。

　　碱裂解法操作简单，（特点） 所得质粒量较多且污染少，（缺点）花费的时间较长。

　　质粒的提取 (Tiangen质粒提取试剂盒 )步骤如下：

　　1、挑菌：选取培养板中大小中等的单个菌落，消毒牙签接种到 10ml 摇菌管中，其中含有卡那霉素的 LB 约5ml ，37 °C，220rpm恒温摇床中震荡培养过夜。

　　2、取上述 2.0ml培养液，于常温下 12000 rpm离心1分钟，弃上清，干燥沉淀。

　　3、 加入250μl溶液P1(配有去 RNA 酶，4 °C保存)，涡旋振荡， 完全悬浮细菌，不能留有沉淀，否则会影响裂解。

　　4、 加入 250μl溶液P2，快速上下颠倒 8次，常温静置 3分钟，可见混合液逐渐变清、粘稠，表示已充分裂解。

　　5、再加入350 μl溶液Ⅲ，快速上下颠倒 8次，可见白色絮状物出现。

　　6、 常温12000rpm离心10分钟，所得上清液倒入已经用 BL平衡过的过滤柱中， 注意不要倒入白色絮状物沉淀，静置 3分钟， 12000 rpm离心1分钟。

　　7、 加入 500 μl 溶液PD，12000 rpm离心1分钟。

　　8、 加入 600 μl 溶液PW，12000 rpm离心1分钟;此步骤再重复 1次;弃废液后空管再次 12000 rpm离心2分钟。

　　9、于超净台通风干燥，放置 2-5分钟，加入 33μl 已加热至 65 °C的已灭菌的 ddH2O，室温静置 3分钟， 12000 rpm离心2分钟，得到相关质粒 DNA ，测浓度， -20 C°保存备用。