我们常常用Transwell实验来进行细胞共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭，相对来说，Transwell的操作简单，而且重复性也比较好，尽管如此，仍然有小伙伴栽在了Transwell上：为什么我的Transwell实验总是失败呢？Bybiotech就为大家梳理一下，Transwell实验中一些需要注意的问题，减少失败的几率。

　　Transwell孔径用对了吗？

　　Transwell技术的名称来自于就是一个叫Transwell小室（如下图），可以放在细胞培养板里面。有不同形状，不同大小，不同选择。但无论如何，它的关键部分都是一样的，那就是杯子底层的那张膜。这张膜一般是聚碳酸酯膜，带有微孔，孔径大小有0.1－12.0 µm。根据不同的实验需要，需要选用不同的孔径，共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究，应用的孔径是有区别的。

　　Transwell小室结构示意图

　　(1).细胞共培养：

　　将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。应选择﹤3.0 µm孔径。因为﹤3.0 µm孔径，细胞不会迁徙通过。

　　(2).细胞趋化:

　　①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。

　　②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。

　　应选择5.0、8.0、12.0 µm孔径，上室细胞可穿过膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。

　　(3).细胞迁移:

　　上室种细胞，一般是具备迁移能力的肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑。应选择8.0、12.0 µm孔径，计数进入下室的细胞量可反映细胞的迁移能力。

　　(4).细胞侵袭：

　　常用8.0、12.0 µm 孔径，原理和方法与细胞迁移实验类似。

　　容易引起Transwell失败的纰漏问题

　　① 重复使用的问题：

　　Transwell小室按照要求，都是一次性使用的。不过因为价格昂贵，其实洗洗泡泡还是可以重复用的。用完后用胰酶和75%酒精泡，室温凉干。再次使用前用紫外里里外外都照上30 min。就可以啦。

　　② 上层培养液：

　　上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。

　　③ 下层培养液：

　　下层培养液采用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度。

　　④ 细胞培养板：

　　常用的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等。细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。但要注意，细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。不要一个大一个小，不配套啊。

　　⑤ 细胞计数：

　　那么，细胞迁移到下室了，如何计数和比较呢？用PBS缓冲液洗细胞1-2次,吸尽残余的液体，加入甲醇固定20分钟,弃固定液,加入结晶紫染液,染色10-20分钟,弃染色液,用PBS冲洗干净即可。如下图所示，哪组迁移的多，哪组迁移的少，是不是一目了然了呢？

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