在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。

　　(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。

　　(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。

　　免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项

　　一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：

　　1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。

　　2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。

　　3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。

　　4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。

　　5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。

　　6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。

　　二、注意事项

　　1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。

　　2、每次试验均需设置以下三种对照：

　　(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;

　　(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;

　　(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

　　三、免疫荧光双标的经验之谈

　　1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。

　　2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。

　　3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

　　4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey血清。

　　5、其余事项同免疫荧光单标操作。

　　免疫组化双重染色方法和步骤

　　在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。目前，最常用的是最后一种方法。

　　不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。

　　SP法双重染色步骤

　　1～6步骤与SABC法相同，但无需使用生物素阻断剂：

　　7.切片加入A特异性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS冲洗3次，每次5分钟

　　8.滴加生物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，继而PBS冲洗3次，每次5分钟;

　　9.滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟

　　10.碱性磷酸酶显色液(BCIP/NBT)显色(紫蓝色).PBS冲洗3次，每次5分钟;

　　11.滴加0.05%盐酸，室温10分钟(可避免已显色的抗原褪色);

　　12.滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清，37~C孵育10分钟;

　　13.滴加B特异性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育。PBS冲洗3次，每次5分钟;

　　14.滴加生物素化抗小鼠二抗，室温孵育切片10分钟。PBS冲洗3次，每次5分钟：

　　15.滴加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟

　　16.过氧化物酶显色液(AEC)显色(鲜红色).PBS冲洗3次，每次5分钟

　　17.苏木精复染细胞核;

　　18.水溶性封片剂封片。

　　在使用SP法双重染色之前需要对待测抗原的性质、二抗的种属类型和显色系统进行详细设计。购买免疫组化双染试剂盒时;应选择与设计方案相同的配套试剂。在选择一抗时应避免定位在细胞的同一部位(如胞核、胞浆和胞膜)的两种抗原，如果不可避免，最好选择免疫荧光组织细胞化学双重染色方法，因为两种不同颜色的荧光重叠后呈现另一种颜色的荧光(如红色荧光与绿色荧光重叠呈现黄色荧光)，它比SP法的显色系统更容易区别和辨认阳性结果。

　　在进行双重染色之前，必须对所选择的一抗分别进行单独染色预实验，预实验条件必须与双染条件相同，在观察预实验结果和抗体定位正确后，再进行双染实验。