本文给大家介绍免疫组化实验注意事项及免疫组化染色实验操作规范，希望大家免疫组化实验做的更能得心应手。

　　免疫组化实验注意事项

　　1. 苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。

　　2. DAB显色时间需要达到*化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。

　　3. 抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育在4度过夜。

　　4. 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片；用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。

　　5. 片子着色不均匀的原因如下：

　　（1） 脱蜡不充分。可以60 ℃烤20 min，立即放入新鲜的xylene1；

　　（2）水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；

　　（3）抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；

　　（4） 抗体孵育时，切片放倾斜；

　　（5）抗体孵育后PBS冲洗不充分。

　　（6） 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。

　　6. 一抗从4 ℃拿出后，为什么有人说要37度复温，目的是什么？

　　（1） 一方面，防止切片从4 ℃直接放入PBS易脱片；

　　（2）另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有用,4 ℃和37 ℃度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。

　　7. 切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？

　　（1） 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制；

　　（2） 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；

　　（3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

　　（4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

　　（5） DAB显色时间过长或浓度过高；

　　（6） PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；

　　（7） 标本染色过程中出现干片，易增强非特异性着色。

　　免疫组化染色实验操作规范

　　1、脱蜡：二甲苯?酒精?蒸馏水

　　2、内源性过氧化物酶的消除：采用过氧化物酶的检测系统，必须进行内源性过氧化物酶封闭处理。如果不进行处理，组织中的红细胞、粒细胞会干扰染色结果的判断。常用0.3%H2O2作用切片10分钟，对染色结果及抗原保存都没有影响，封闭效果比较显著。

　　3、血清封闭：在加入一抗前需用二抗的正常血清进行封闭，可以减少非特异性结合。目前使用的二步法检测系统可以免去这一步骤。

　　4、抗体使用：已有大量的即用型抗体供实验室使用，厂家已进行过多次的实验检测，可按厂家提供的条件进行操作。浓缩型抗体一般按照厂家提供的建议稀释度，进行对倍稀释预实验。选定*的稀释滴度后再进行批量实验。染色背景深大多是抗体浓度过高所致。抗体孵育温度一般以常温25℃为基准或37℃30分钟，也可4℃冰箱过夜。

　　5、冲洗：常用的冲洗液为PBS或TBS缓冲液，要严格执行冲洗步骤，防止因冲洗不净引起的背景着色，缓冲液中加入Tween20可以增强冲洗效果。

　　6、检测系统：通用的检测系统有生物素标记的ABC、SP、LSAB等，此类检测系统较为经济，日前仍有不少医院在使用。非生物素类检测系统价钱较贵，由于不需通过生物素的结合，可以避免内源性生物素的干扰，其特点：敏感、省时、方便、背景低。

　　7、显色系统：由于检测系统采用的是辣根过氧化物酶，因此选择DAB（棕色）和AEC（红色）作为酶的底物，若采用碱性磷酸酶系统则选择BCIP/NBT（蓝紫色），常规免疫组化显色的仍然是DAB，定位清晰，易于保存。AEC不能耐受酒精及敏感性低，BCIP/NBT阳性虽鲜艳，但阳性定位不准确。

　　8、复染：衬染步骤十分简单，但衬染的好坏对染色zui终结果的质量影响很大。有的选用Harris苏木素，有的用Mayer’s苏木素，且与DAB染色对照效果，在绝大多数实验室中使用简单方便。也有实验室使用甲基绿衬染衬染，但不能经有机溶剂，容易退色。