免疫组化染色前处理技术操作规范

　　1、取材：理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm，大多数实验室都认为组织在加热抗原修复过程中造成脱片的主要原因是取材过厚或脱水浸蜡处理不当所致。良好的取材、固定、脱水过程是免疫组化质控的前提，如果H&E切片都做不出满意的染色结果，那么免疫组化染色也将无从谈起，根本无法保证染色质量。

　　2、固定：在众多的组织固定液中（如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛 等），不同的实验方法在使用上各有千秋。但在保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性以及试剂的价格上，福尔马林是、既经济又通用。而含酸或含汞的固定液对抗原保存均不理想。组织离体后固定一般不要超过30分钟，在常温条件下固定时间为8-24小时。同时还要注意避免福尔马林过度固定造成的组织抗原丢失，有研究发现新鲜组织经过福尔马林一周固定后组织抗原丢失严重，抗原几乎不能被检测，因为组织固定后会引起蛋白或蛋白分子之间形成交联，导致抗原位点遮盖，可以通过抗原修复方法来修正，若加抗体前不采用抗原修复，则免疫组化染色常不能到达理想结果或不成功。组织同样不能长时间放置在70%的乙醇中，酒精固定后的组织形态不如福尔马林固定的组织。脱钙液对抗原破坏较为严重，因此在组织脱钙前在福尔马林液中固定48小时，若组织没有固定透则酸会破坏抗原，脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控制在zui低的限度。

　　3、浸蜡：我们认为浸蜡温度应控制在58~60℃左右，浸蜡用的石蜡应经常更换，以减少石蜡中二甲苯的含量。高温下的二甲苯容易使组织发脆，细胞收缩，更容易掉片。

　　4、切片厚度：用于免疫组织化学染色的切片厚度为3-4微米。为防止在染色过程中脱片，需要使用硅化玻片裱片。

　　5、硅化玻片的制备：载玻片经酸洗冲洗干净后烤干； 2%APES丙酮或无水酒精中浸泡1~2min；丙酮或无水酒精洗1~2分钟；蒸馏水浸洗1~2min；烤干备用。

　　6、烤片：切片在60℃~65℃烤箱中烤片30-60分钟左右。有些实验室采用烤片过夜。有报导烤片温度超过60℃时，烤片时间超过18小时的切片，免疫组化染色强度比烤4小时的切片要略弱。温度过高或时间过长均会影响抗原的活性，原因是在高温干燥条件下可以加速组织切片中抗原的氧化。

　　7、切片保存：一些实验室研究人员习惯将组织蜡块连续切片后长期保存在室温条件下，切片后的组织在室温下长期保存抗原可以损失。迈新实验室在实验中发现蜡块切片后，在室温下保存三个月以上，免疫组化染色结果会出现减弱或阴性情况。并进行了新、旧切片的保存时间对照实验，选择11种不同组织蜡块每例连续切片10片，共110片，常温空气中放置一个月、三个月、半年、一年与新切片进行成对对照实验。实验结果表明：组织蜡块切片后在室温下保存三个月，抗原对多数抗体的敏感性约下降一半，部分切片丢失更多。切片保存半年多数的抗体不能出现阳性标记结果，保存一年以上仅有个别的切片能够有微弱的阳性表达，尤其核表达的抗原丢失更为突出。国外也有类似的资料报道。其原因可能与空气中的氧化作用有关，所以在实际工作可以采用蜡封切片来避免抗原损失以便长期保存，也可4℃冰箱冷藏保存，尤其是用于科研集中实验的切片更应注意切片的保存。

　　8、脱蜡：免疫组化的脱蜡步骤与常规H&E脱蜡步骤相同，免疫组化实验室中脱蜡需与H&E常规脱蜡分离，以保证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。

　　免疫组化染色呈阴性结果的解决方案

　　1、首先，排除组织切片内的抗原有无丢失及其含量多少。免疫组化中两个zui重要的因素是抗原和抗体。（1）抗原有无丢失主要看组织切片的新鲜程度，一般切片室温保存超过3-6个月，可能切片内的抗原丢失很严重（有文献支持），此时可以通过重新用石蜡块切片来进一步验证（蜡块需要低温保存）。（2）石蜡切片在制作过程中可能因醛基对抗原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充分暴露，从而增加抗原抗体结合反应，提高阳性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修复，用枸橼酸钠缓冲液。（3）组织切片中本身抗原含量的多少？这方面我有教训的，我做胎鼠睾丸间质细胞鉴定，用1：200一抗效果很好；但我用1：200一抗孵育成年睾丸间质细胞检测，几乎呈阴性，后来证实是因为两者抗原含量相差甚远，则一抗也要适当提高浓度。

　　2、其次，检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件是否不适。（1）一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好；一抗的species reactivity中无检测组织的种属，这是比较常见的错误；一抗选择rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。（2）抗体孵育时间过短，容易导致阴性结果。一般一抗我建议4度孵育过夜和37度复温45min；二抗我一般37度30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。（3）抗体浓度过低。这是阴性结果的zui可能原因。必须提高稀释度，我一般初次做一种新抗体，喜欢先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次，然后决定是向高还是低方向摸索。一般先决定二抗的浓度（工作液就好办了，直接滴加），重点摸索一抗的zui适浓度。注意：免疫反应中存在前带和后带效应，这提示不是浓度越高，阳性率就越高，反之亦然。（4）重要原因排除之后，也不要忽视抗体的质量：原装抗体一般比较稳定，效果较好；而进口分装次之；工作液可能要注意质量问题。

　　3、同时，DAB的孵育时间可能要适当延长，在镜下观察，有时可延长至30min。但一般3-10min，此时背景也较浅。否则，说明抗体浓度不合适。

　　4、zui后，血清封闭时间也可相应缩短。一般10-30min，但这个时间可以调整，封闭主要是降低切片的总体背景着色。

　　5、此外，细胞通透也不可忽视。许多战友认为石蜡切片一般不需细胞通透，因为切片时可能已经把细胞切开了，但对于胞核蛋白，建议还是通透一下，促进抗体等试剂充分进入参与反应。

　　6、以上原因，都是针对实际中常见原因来进行分析的，前提是排除操作者的操作错误而引起阴性结果，这就需要新手还是要设置阳性对照以排除方法的问题。还有抗体稀释液的PH值过低等其它原因的干扰。