什么是免疫荧光？

　　免疫荧光（简称 IF）是生物学中的一种方法，它依赖于使用荧光染料化学标记的抗体在光学显微镜下可视化分子。对于成功的 IF 染色，拥有能够特异性检测感兴趣分子内的抗原的良好抗体至关重要。

　　该抗体（通常称为一抗）与荧光染料共价连接，或随后与不同来源的特定二抗（称为二抗）结合，该二抗将被所需的荧光染料标记。第一种情况称为直接免疫荧光，而第二种情况称为间接 IF。这两种方法都允许使用附着在具有不同发射光谱的荧光团上的抗体来可视化不同标记的抗原，这意味着它们可以使用单独的激光线进行成像。

　　免疫荧光检测格式

　　有两类 IF 技术：主要（或直接）和次要（或间接）：

　　主要（直接）

　　初级或直接免疫荧光使用与荧光染料直接偶联的单一抗体。抗体识别目标分子并与之结合，然后可以使用显微镜检测结合的荧光染料。该技术减少了染色过程中的步骤数量（使其更快），并有助于避免可能导致背景信号增加的抗体交叉反应性或非特异性问题。然而，这种方法缺乏间接方法固有的任何信号放大，并且需要科学家费力地结合潜在的多种所需的不同一抗。

　　次要（间接）

　　二抗或间接免疫荧光使用两种抗体：一抗识别目标生物分子并与之结合，二抗与荧光染料偶联，后者识别并结合一抗并间接定位目标以进行检测显微镜。虽然该协议比直接方法更复杂，但它在实验设计方面更灵活，通过放大产生更大的信号检测，并且由于二级抗体偶联物可商购而更容易。

　　免疫荧光技术

　　免疫荧光 (IF) 显微镜是一种广泛使用的免疫染色示例，是一种基于使用荧光团来可视化结合抗体位置的免疫组织化学形式。这是一种特别稳健且广泛适用的方法，研究人员通常使用它来评估感兴趣的蛋白质的定位和内源性表达水平。

　　该方法的有效应用包括几个考虑因素，包括抗原的性质、一抗的特异性和敏感性、荧光标记物的特性、样品的透化和固定技术以及细胞的荧光成像。尽管每个协议都需要根据细胞类型、抗体和抗原进行微调，但几乎所有应用都有一些共同的步骤。有关更多信息，请参阅我们的成功 IF 显微镜技术提示。

　　免疫荧光可用于组织切片、培养细胞或通过多种方法固定的单个细胞。在这种方法中，抗体可用于分析蛋白质、糖蛋白和其他抗原靶标的分布，包括小的生物和非生物分子。

　　IF 显微镜可用于多种显微镜设计，用于分析免疫荧光样品。最简单的是荧光显微镜。虽然共聚焦显微镜被广泛使用，但超分辨率显微镜的新设计，如 STED（受激发射耗尽）显微镜等，允许进行纳米显微镜检查，并且能够获得更高的分辨率。

　　为什么免疫荧光很有用

　　免疫荧光通常用于分子和细胞生物学实验室，是一种可靠且简单的方法，可在广泛的固定细胞或组织上可靠地定位分子。IF 染色提供了一种独特的可能性，可以揭示处于“天然”状态的分子，最大限度地减少使用荧光蛋白标记时可能发生的蛋白质构象、定位和/或功能的潜在扰动。

　　同样，在研究稳态或内源性蛋白质水平和定位时，免疫荧光具有非常丰富的信息——另一方面，荧光蛋白有时可以多聚化或影响分子的动力学和表达水平。