1、切片：

①　包埋好的蜡块用切片机进行切片

②　将切成的蜡带平铺在水浴锅中

③　等待切片完全展开后有防脱载玻片轻轻将切片捞起，使其贴在载玻片上

④　将载玻片放在切片架上

2、烘片：70℃烘片30-40min

3、脱蜡水化：将切片依次浸入以下溶液

①　二甲苯Ⅰ15min

②　二甲苯Ⅱ15min

③　无水乙醇5min

④　90%乙醇3min

⑤　80%乙醇3min

⑥　70%乙醇3min

⑦　蒸馏水3min*3次

⑧　PBS 3min*3次

4、阻断内源性过氧化物酶：

①　将3%过氧化氢倒入染色缸

②　将切片放入染色缸中

③　避光孵育20min

④　将切片浸泡于PBS 3min*3次

5、抗原修复：

①　将柠檬酸钠稀释50倍

②　将50x缓冲液中加入到1L的烧杯中，再加入的蒸馏水，玻璃棒搅拌均匀

③　用微波炉煮沸

④　将组织切片放入烧杯中

⑤　调至中火（P50），保温20min

⑥　修复结束后，将烧杯拿出，烧杯和切片一同室温冷却至室温（注：不要将切片从烧杯中拿出）

⑦　PBS 3min*3次

6、封闭：

①　用吸水纸将组织周围的水小心吸干净

②　用免疫组化笔在组织周围画圈以防止后续抗体流出

③　在圈中滴加5%山羊血清封闭液至覆盖组织

④　将切片平放于湿盒中，室温孵育30min

7、一抗孵育：

①　甩掉封闭液，滴加一抗使其覆盖组织

②　放入湿盒中，4℃孵育过夜
8、清洗：

①　第二天取出湿盒后，室温复温30min

②　回收一抗

③　将切片依次浸入PBS 3min*3次，蒸馏水5min*2次

9、二抗孵育：

①　切片甩干水分并吸走水珠

②　滴加二抗使其覆盖组织

③　室温孵育120min或4℃孵育过夜

10、洗涤：

①　去除二抗工作液

②　缓冲液TBST洗涤 5min

③　缓冲液TBS洗涤 5min*3次

11、DAPI孵育：

于样本上滴加DAPI工作液，避光，室温孵育10min

12、洗涤：

①　去除DAPI工作液

②　缓冲液TBST洗涤 5min

③　缓冲液TBS洗涤 5min*3次

13、加入放荧光猝灭剂

14、封片：

①　风干组织切片

②　用胶头滴管将中性树脂滴在组织上

③　盖上盖玻片后轻轻按压，使中性树脂覆盖组织，静置晾干

15、荧光显微镜观察并记录