1.样品制备

    ①　将样品注射器中的样品转移至离心管中

    ②　加入适量的缓冲液、酶切酶和特定的引物

    ③　混匀离心管，置于适当的温度下反应一段时间

    ④　利用离心机进行离心，去除离心管中的杂质

    ⑤　将样品转移至PCR管中，进行PCR扩增反应

2.文库构建

    ①　将PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离

    ②　提取目标片段，并使用DNA提取试剂进行纯化

    ③　根据实验要求，进行连接反应、连接纯化和连接鉴定等步骤

    ④　根据实验设计，选择合适的DNA纯化方法，提取纯化后的文库DNA

3.过滤片段

    ①　准备合适的过滤器和物理过滤装置

    ②　将文库DNA注入过滤器中，加入适量的缓冲液进行过滤

    ③　收集过滤后的片段，并进行定量和质量评估

4.测序反应

    ①　将过滤后的片段注入到测序仪中

    ②　设置适当的实验参数，进行测序反应

    ③　根据测序仪的要求，采集测序数据，并进行数据质量控制

一代测序技术：以Sanger法为代表。Sanger法又叫作双脱氧链终止法，它以DNA合成反应为基础，常用于测定DNA序列。Sanger法操作步骤如下：首先在每个反应体系中加入同位素标记的引物、待测的DNA片段、足够量的脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP和dTTP）和DNA聚合酶。然后在四个反应体系中分别加入少量的2’，3’-双脱氧核苷三磷酸（ddATP、ddGTP、ddCTP和lddTTP）进行PCR反应。以加入ddATP的反应体系为例，每次合成反应如果配对的为ddATP，反应就会停止，如果为dATP，反应可以继续，直到与ddATP配对反应才会停止，所以在该反应体系中会得到长短不一的，以ddA结尾的片段。再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离四个反应体系中的产物并进行放射自显影，得到图谱后，读取核苷酸的排列顺序。

二代测序技术：20世纪90年代，在基因组学发展的需求下，科研人员开发了通量更高、成本更低的测序技术。为了与以Sanger法为代表的一代测序技术进行区分，他们将后来发展的测序技术称为二代测序技术。二代测序技术通常先将样晶DNA打断成几百个碱基对长的片段，然后在片段两端加接头，进行PCR扩增和序列分析。二代测序技术也有一些缺点：测序产生的都是一些较短的序列，后续序列拼接的工作比较复杂；PCR扩增前后的DNA片段数目比例会有差异，不利于进行生物信息学分析。

三代测序技术：三代测序技术与二代测序技术相比，获得的序列较长，后续序列拼接的工作相对简单。总的来说，三代测序技术相较于前两代测序技术，具有超长读长、运行快、无须模板扩增、可直接检测表观遗传修饰位点等特点，它主要用于基因组测序、甲基化研究、突变鉴定等领域，所得数据适于进行生物信息学分析。虽然三代测序技术的优点非常多，但该技术尚处于发展阶段，还未成熟和实现多元化，成本较高，目前多用于科学研究，商业化程度较低。