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实验原理
免疫共沉淀是以抗原和抗体结合的专一性为基础,来研究蛋白质与其他分子(如蛋白质、RNA)之间相互作用的经典方法。 -
实验步骤
1.样本制备:
①细胞样本:收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂,冰上裂解,超声破碎,离心,取上清
②组织样本:剪碎组织,按组织量加入裂解液和蛋白酶抑制剂,匀浆器匀浆直至充分裂解,离心,取上清
2.结合抗体:按照抗体网站推荐的使用比例,向预备好的裂解物中添加一定量的相应抗体,4℃缓慢摇晃孵育过夜
3.免疫复合物沉淀:加入一定量的protein A和protein G,4℃缓慢摇晃孵育1~3小时或过夜,离心保留沉淀,并清洗沉淀3次
4.脱离抗体:根据样本的性质和下游检测手段,选择合适的洗脱缓冲液,使用洗脱缓冲液将互作蛋白复合物与珠子分离
5.分析:将沉淀的免疫复合物及其相互作用的分子进行后续分析,如Western Blot、质谱分析等
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实验结果