原代细胞培养实验注意事项详解(原代细胞培养的实验过程)

　　原代细胞的培养步骤

　　一、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)培养要求

　　1、细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性；

　　2、细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L；

　　3、培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养；

　　4、小牛血清浓度为10%-80%；

　　5、应在37℃5% CO2的培养箱中培养；

　　6、在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮；

　　7、待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，应将原代细胞换液；

　　8、用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，应将细胞悬液经低速离心后换液。

　　二、悬浮细胞的培养要求

　　1、原代培养时要尽量去除红细胞；

　　2、短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行；

　　3、细胞浓度可在5-8×109/L范围内进行分瓶试验；

　　4、长期培养时，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长；

　　5、细胞换液一般每隔3天需半量换液一次；

　　6、细胞传代一般待细胞增殖加快、细胞密度较高时才能进行。

　　三、原代细胞的维持

　　1、贴壁细胞长成网状或基本单层时，未达到饱和密度，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要；

　　2、换入等量完全培养基或换成含2%小牛血清的维持液；

　　3、悬浮细胞细胞培养基中不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，需进行换液。通常采用半量换液的方法；

　　四、原代细胞培养的*传代

　　原代培养后由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达饱和密度；贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。

　　*传代应注意以下几点：

　　(1)细胞生长密度不高时，不能急于传代。

　　(2)原代培养的贴壁细胞需控制消化时间。

　　(3)吹打已消化的细胞应减少机械损伤。

　　(4)*传代时细胞接种数量要多一些。

　　(5)*传代培养的pH应偏低些。小牛血清浓度可加大至15%～20%左右。

　　五、其他培养法

　　（一）组织块培养法

　　组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法。其基本方法是将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长。

　　（二）悬浮细胞培养法

　　对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。

　　（三）器官培养

　　器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细间的联-系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。