细胞传代的时间把握

　　当细胞呈指数增殖，贴壁培养的细胞已占据所有可用基质、没有扩增空间，或悬浮培养的细胞已超过培养基质所支撑的能力，无法进一步生长时，细胞增殖速度将大大降低甚至完全停止。

　　为了将细胞密度维持在最佳水平，以便细胞继续生长，并且刺激进一步增殖，必须对细胞进行传代。

　　养细胞的小伙伴们都知道，细胞一定要传代，因为细胞在培养过程中不断的繁殖，数量也随之增加，然而培养皿/培养瓶的空间有限，增殖受到抑制，所以必须将一部分细胞移至别的培养皿/培养瓶，让细胞有足够生长空间。

　　细胞传代也不仅仅是为细胞安一个更大的“家”，更重要的，是使细胞系或细胞株进一步增殖，这样，我们才能有足够的细胞做各种各样的实验。

　　但是，对于传代的时间，很多小伙伴都掌握不好，因为对于不同的细胞来说，判断能否开始传代的标准略有不同，今天，我们就主要来聊一下，细胞传代的时间问题。

　　什么时候进行细胞传代?

　　对于贴壁培养和悬浮培养而言，判断是否需要传代主要看以下2个方面：

　　• 细胞密度：

　　贴壁培养细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时即应进行传代，正常细胞达到汇合状态时会停止生长 (接触抑制)，重新接种后需要较长时间才能恢复，转化细胞即使达到汇合状态也能继续增殖，但是在经过大约两个倍增时间后通常会变质。类似地，

　　悬浮培养的细胞进入对数生长期、未达到汇合状态时也应进行传代。达到汇合状态时，悬浮培养的细胞会聚集成团块，转动培养瓶时培养基会变得浑浊。

　　• 培养基耗竭：

　　生长培养基 pH 值降低通常表示乳酸蓄积，乳酸是细胞代谢的副产物。乳酸有细胞毒性，而且 pH 值降低也是细胞生长的不利因素。pH 值改变的速度通常取决于培养体系中的细胞浓度，细胞浓度越高，培养基耗竭的速度越快。

　　如果发现 pH值迅速降低 (> 0.1–0.2 pH 单位)，同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。

　　细胞传代时间安排

　　注意，一定要严格按照预定时间进行细胞传代，这样才能确保细胞的生物学行为稳定，便于监测其健康状态。

　　要从某一接种密度开始逐渐调整细胞接种密度，直到达到适合该细胞的稳定生长速度和产量，细胞偏离如此确定的生长模式通常表示细胞健康状况不佳 (例如：变质、污染) 或者培养体系的某一组分功能异常 (例如：未达到最佳温度，培养基过于陈旧)。

　　强烈建议大家保留详细的细胞培养记录，记录加料和传代时间、所用培养基种类、解离方法、分种率、形态学观察结果、接种浓度、产量和抗生素用法。

　　最好按照传代时间安排开展实验和其他非常规操作 (如更换培养基种类)，如果您的实验安排与常规传代时间安排不吻合，则应确保当细胞仍处于延滞期或者已经达到汇合状态、停止生长时，不进行传代。

　　贴壁细胞传代流程:

　　以下实验方案介绍了贴壁细胞和悬浮细胞传代的一般流程,为自己所用的细胞系传代时，建议您严格遵守实验中所有产品附带的操作说明,偏离某种细胞所需的培养条件会导致细胞表型异常，甚至培养完全失败。

　　(1)传代前准备

　　用具紫外照射消毒(30min)：无菌培养瓶，15ml离心管，移液管，移液枪，枪头。

　　倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。

　　(2)胰蛋白酶/EDTA消化

　　从培养箱中取出待传代的细胞(将盖子拧紧)，75%酒精进行瓶口消毒，吸掉培养细胞的旧培养基，PBS缓冲液洗去残留的旧培养基，按25m2/ml消化液比例加入消化液，消化液中EDTA浓度视不同细胞而定。放入显微镜下观察，待所有细胞变圆后立即拿入超净台内，加入6ml细胞完全培养基中止消化，消化时间为1-5min，具体以细胞而议，采用无菌吸管轻轻吹打细胞表面，注意吹打全部培养表面，可以按照先左右吹打，后上下吹打的方式，取所有的细胞悬液放入干净的15ml离心管内，每分钟1000rpm，RT5min。

　　(3)制备细胞悬液及培养

　　吸取上清液丢弃，不要吸到底部的细胞沉淀，向离心管内的细胞沉淀加入适量完全培养基，吹打混匀，吹打过程中尽量不要产生气泡，以1:2的比例进行分瓶。

　　(4)结果观察

　　第二天观察细胞情况，细胞培养换液时间一般2-3天。

　　(5)注意事项

　　1 严格无菌

　　2 适度消化：把握好消化液的最佳浓度

　　3 吹打细胞动作要轻柔

　　悬浮细胞传代流程

　　悬浮细胞传代就比较容易了，可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液即可。当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离心管内，1000-1500rpm离心3min，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中，然后置于二氧化碳培养箱中培养。

　　看了以上的内容，你学会了吗？细胞传代是一个需要不断积累经验的技术活儿，除了对时间的把握之外，还有很多方面需要我们注意。