免疫组化流程图

　　免疫组化的标本主要是组织标本和细胞标本两大类。组织标本中包括石蜡切片（标本制作的首选方法）和冰冻切片。一般而言，石蜡切片要求薄厚均匀，切片完整，且无褶无刀痕。

　　1）脱蜡与水化：将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接对着切片冲洗）。PBS洗3次，3 min/次。

　　2）细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片30min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。PBS洗3次，3 min/次。

　　3）抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。

　　这里常用微波修复，pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。PBS洗3次，3 min/次。

　　4）血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。此时可用“祖传”的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。

　　5）孵育一抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的一抗20ul，4℃过夜或者37℃ 1-2h。PBS洗3次，3 min/次。（一般4℃过夜后，需要将切片放置37℃复温45min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）

　　6）孵育二抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的二抗20ul，37℃ 1-2h，PBS洗3次，3 min/次。

　　7）切片显色：用DAB-H2O2显色10min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10min内即可用蒸馏水终止显色。

　　8）复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用Mayer苏木素染色30s，水洗，盐酸酒精分化2s，流水浸入15min。脱水时，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各2min。二甲苯5min使切片透明化，最后加入中性树胶封片（一般封片后最好立即拍照，若不能及时拍照，可用指甲油封固并保持好避光和湿度）。