组织块法原代培养实验原理

　　组织块法原代培养的基本原理是将将刚离体的、有旺盛生长活力的组织剪成小块，接种于培养瓶中，新生的细胞大约 24 h 后可从贴壁的组织块四周游出并生长。

　　利用此法进行的原代培养，操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活。

　　组织块法原代培养实验材料与仪器

　　器材：

　　① 大鼠

　　② 眼科剪、眼科镊

　　③ 培养皿、培养瓶

　　④ 弯头吸管

　　⑤ DMEM 培养基

　　试剂：

　　① 75% 乙醇

　　② D-Hanks 液

　　组织块法原代培养实验步骤

　　组织块法原代培养实验的基本过程可分为以下几步：（以新生大鼠肝细胞的原代培养为例）

　　A. 用 75％ 乙醇棉球反复擦拭新生大鼠全身 3 遍。

　　B. 将大鼠移入超净工作台后，再用 75％ 乙醇擦拭 1 次。

　　C. 处死大鼠（断头法），用眼科剪打开腹腔，取出肝组织，置于培养皿中。

　　D. 用 D-Hanks 液反复冲洗肝组织 3 遍，去除血细胞。

　　E. 为避免杂细胞的污染，需用眼科镊将肝组织块上所附的结缔组织尽可能去除。

　　F. 将肝组织移入一新的培养皿中，滴 0.5 mL 培养基于肝组织上，用眼科剪将其剪成 1 mm3 左右的小块，同时用眼科镊将其彼此分开。

　　G. 用弯头吸管将剪碎的肝组织块吸起，移入培养瓶底部。

　　H. 用弯头吸管头移动肝组织块，使其均匀分布于培养瓶底部，小块间距控制在 0.5 cm 左右，数量为 15～20 块/培养瓶（25 mL）。

　　I. 吸取少量培养基，沿培养瓶颈缓缓滴入，培养基的量以恰好能浸润组织块底部、但不会使组织块漂浮为佳。

　　J. 将培养瓶轻轻放入培养箱中培养。

　　K. 24 h 后，可观察到有少量细胞从组织块周围游离而出，视需要补以少量培养基。

　　组织块法原代培养实验注意事项

　　1. D-Hanks 液对肝组织的冲洗要充分，尽量去除血细胞，避免其溶血后对肝细胞的生长产生影响。

　　2. 组织块的体积应控制在 1 mm3 左右，这样其中心部位的细胞才可获得充足的养分。体积过大的组织块其中心部位细胞常会因营养不足而发生死亡、溶解，由此会对周围细胞的生长产生影响。

　　3. 培养瓶中组织块摆放的密度不能过大，否则细胞将会因为营养不足而活性不佳。此外，为了避免组织块漂浮、不贴壁，第一次加入培养基的量要少，而在移动和观察细胞时，动作也要轻，因为培养基的振荡也会影响组织块的贴壁。

　　4. 由于原代培养过程较长，因此，应严格无菌操作，避免细菌、霉菌等的污染。