分子生物实验常规实验（分子生物学一些基本实验）

　　1、western blot蛋白印迹

　　是一种从多种蛋白质中识别目标蛋白的方法。利用分子量大小，将蛋白通过凝胶电泳分离，然后使用特定抗体确认目标蛋白。

　　①样品准备：细胞溶解（将样品在细胞溶解缓冲液搅拌是均匀化，离心，收集上清液）；测量一个蛋白质的浓度，确保在每个样本中装载等量的蛋白；还原和变性，目的是打破高级结构，使蛋白质能够在电泳中进行分离。

　　②蛋白电泳（SDS-PAGE）

　　SDS与蛋白结合，使蛋白带上负电荷，当通电时，蛋白向正极移动，分子量越小，移动的越快。

　　③转移

　　凝胶不适用于免疫检测的基底，所以一般要把蛋白从凝胶转到膜上，一般是硝化纤维膜/PVDF

　　在夹层中依次放入上图中的东西，膜靠近正极，因为蛋白是向正极移动的。凝胶与膜之间要避免有气泡，因为空气是不导电的。然后放入转移槽。加甲醇可以使蛋白与SDS分离，蛋白被转移到膜上，不会再继续向正极移动。可以加入可逆的蛋白染色剂，确保蛋白被完全转移到膜上。

　　④封闭

　　避免抗体的非特异结合，封闭缓冲液一般是5%的牛奶或者牛血清白蛋白、BSA等

　　⑤加抗体

　　先加一抗，再加二抗。

　　如果是化学发光检测的话，使用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的抗体，需加额外的发光底物。

　　如果是荧光检测的话，荧光基团已经被偶联到二抗上，不需要加额外的发光底物，检测荧光基团即可。

　　⑥检测

　　2、ChIP染色质免疫沉淀

　　染色质由蛋白质和DNA组成，其基本单位是核小体(组蛋白+DNA)，核小体核心由八聚体组蛋白加缠绕的DNA组成，组蛋白H1位于结构的顶部，使DNA缠绕保持在原位。更松弛的染色质被称为常染色质，随染色质进一步聚集，常染色体变为异染色体。

　　组蛋白修饰和DNA甲基化是控制基因转录的主要表观遗传机制。

　　乙酰化一般与激活基因有关，多发生在启动子区。不同的甲基化修饰则通过松弛或凝聚染色质而激活（H3K4的二甲基化）或抑制基因（H3K27的二甲基化）。

　　ChIP基本原理：在活细胞状态下固定DNA-蛋白质复合物，随机切断成染色质小片段，免疫沉淀此复合物，富集与目的基因结合的DNA片段，对DNA片段进行纯化和检测，从而获得蛋白与基因相互作用的信息。

　　3、抗体

　　两种形式：单克隆和多克隆

　　多克隆抗体不能无限扩增，需再次进行免疫，会引起批间差异。

　　单克隆抗体由杂交瘤细胞系产生，将B细胞与骨髓瘤或瘤细胞系融合，分离和永生化B细胞。杂交瘤细胞可产生特异识别靶蛋白单个表位的抗体。

　　多克隆抗体可与同一蛋白上的多个表位结合，可能会使每次实验的数据不一致。

　　单克隆抗体始终与同一蛋白上的单个表位结合，可以得出准确可重复性的数据。

　　重组抗体：将B细胞的抗体编码基因克隆至某一载体，导入哺乳动物细胞系表达这些基因，即得到重组抗体。一般就是免疫兔子，分离，扩增B细胞，然后克隆分泌抗体的细胞，或者用杂交瘤细胞DNA序列合成克隆，并在哺乳动物细胞系中表达该克隆。

　　4、流式细胞术FCM

　　流式细胞技术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。

　　工作原理图：

　　流式细胞仪检测时需将待测细胞制成单细胞悬液，以保证细胞逐个地通过受检，然后稳定地流动，依次经过喷嘴，恒定通过激光束的焦斑区，被功率恒定的激光束激发而产生散射光和激发荧光。

　　散射光包括前向角散射光( Forward Scatter , FSC )和侧向角散射光( Side Scatter , SSC )。FSC反映了被测细胞的大小。SSC 提供了细胞表面状况、胞内精细结构和胞质颗粒性质的信息，SSC 信号越强，细胞内颗粒越多。散射光和荧光 FCM 中区分不同细胞类型的依据。

　　流式细胞仪可以对分析中的目的细胞进行分选提取，它是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷嘴上安装有超高频的压电晶体，可以产生高频振荡，使液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就包含在液滴之中。将这些液滴充上正电荷或负电荷，当带电液滴通过电场，在电场的作用下发生偏转，然后落人相应的收集器之中，从而实现细胞分选。

　　①样本制备：制成单细胞悬液

　　②染色

　　荧光染料：常用的有FITC，PE，PI，CY5，preCP等。

　　直接染色法：

　　第一步是单细胞悬液，第二步是封闭，第三步是一抗与样本孵育，一抗直接与荧光染料偶联，第四步是固定，固定剂可以是酒精或者甲醛、多聚甲醛等。第五步是在流式细胞仪中跑样，跑样前确保单细胞悬液混合均匀。

　　间接染色法：步骤与直接一样，不同的地方在第三步，一抗未用荧光染料进行标记，但其可以与生物素偶联，洗涤后与二抗（荧光染料标记的）一起孵育。如果是与生物素偶联的一抗，要将其与荧光染料偶联的亲和素一起孵育。

　　③数据分析

　　“设门”：就是在细胞分选图上圈出某一区域，对其中的细胞进行分析。

　　FCM根据淋巴细胞表面标志的不同来检测各淋巴细胞亚群。

　　淋巴细胞主要包括 T 淋巴细胞(CD3+)，B淋巴细胞(CD19+)，NK细胞(CD16+CD56+)。总T淋巴细胞和总B淋巴细胞可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病; NK细胞(CD16+CD56+)行使免疫监控功能,能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。根据CD4、CD8的表达, T 淋巴细胞又分为 T 辅助/诱导细胞( Th )(CD3+CD4+)和细胞毒性T细胞( Ts )(CD3+CD8+)。Th / Ts 比值升高:自身免疫性疾病; Th / Ts 比值降低:病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血。

　　以双色淋巴细胞亚群分析试剂检测样本的试剂(以CD3 FITC /CD4 PE 单克隆抗体试剂为例)进行介绍。

　　如图根据淋巴细胞的FSC和SSC设门：淋巴细胞的个体比较小（FSC），细胞内颗粒较少（SSC）。然后对该细胞群进一步分析。

　　单参数分析：x轴是荧光信号的强度；y轴是该通道内出现具有相同光信号特征细胞的频度，一般是相对细胞数。CD3阳性细胞的相对计数结果为70.8%。

　　多参数分析：x轴和y轴是不同通道荧光信号的强度。CD3+CD4+细胞的相对计数结果为45.2%。F3是双阴性，F4是双阳性。

　　5、IHC免疫组化

　　免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

　　①石蜡切片

　　组织包埋于石蜡中切片，冷冻石蜡更易切片。在切片机上切，切好的薄片浮于水浴锅中，以消除褶皱。用玻片取出，应避免产生气泡。

　　②染色过程

　　免疫组化有荧光标记和酶标记。酶标记使用辣根过氧化物酶HRP或碱性磷酸酶AP，它们有不同的底物，可显示不同的颜色，二抗和酶偶联，加入底物后，显色。荧光标记是二抗偶联荧光染料。荧光标记能更好的进行复染色，更灵敏。

　　酶标记为例

　　脱蜡：将玻片放入脱蜡剂（二甲苯）的培养皿中摇晃，再依次经过酒精浓度递减的培养皿，纯水孵育，PBS孵育。

　　抗原修复：酶法和热介导法（将玻片放入含有抗原修复缓冲液的高压锅中，取出，清洗）。石蜡切片由于处理过程中会造成抗原交联而影响染色结果，故通常需要进行抗原修复以增强显色。多数抗原可以通过抗原修复试剂预处理，改变醛基固定造成的蛋白交联，以暴露隐藏的抗原位点。

　　封闭组织切片：使抗原非特异性相互作用最小化。内源性酶会造成假阳性染色，所以抗原修复后要加封闭溶液。使用免疫组化笔在组织切片周围划出疏水屏障，加封闭溶液。

　　免疫反应：加一抗放冰箱（4℃）隔夜培养，清洗，加二抗室温孵育（联有辣根过氧化物酶）。

　　加底物：将3，3'-二氨基联苯胺DAB加入组织切片，DAB是HRP（辣根过氧化物酶）的底物，会产生明显的棕色沉淀物。

　　复染：苏木素复染。

　　脱水封片：与脱蜡步骤相反

　　观察：加一滴中性树胶，盖上盖玻片，在显微镜下观察。

　　结果分析：苏木素复染细胞核后，细胞核被染上蓝色,实验组胞浆间呈现棕黄色,阳性信号较强;阴性对照组胞浆不被 DAB 染色。

　　6、细胞计数

　　细胞计数板：有两个计数池，两端上样（细胞混悬液），两侧是盖玻片支架

　　计数池：四角是16方格，中心是16方格组成的25方格。

　　计数：细胞较少的时候，数四角的16方格有多少个细胞，算出四个角的平均数，比如等于30。那么，每毫升细胞数=30x10000；细胞中等时，数四角的16方格的一小格有多少个细胞，比如有20个，那么，每毫升细胞数=20x10000x16；细胞较密的时候，数中心25方格中的一个16方格有多少个细胞，如果有20个，那么，每毫升细胞数=20x10000x25。要是取样取2mL，还要在上述基础上x2，如果稀释了，还要乘稀释倍数。活细胞计数：将细胞悬浮液稀释到台盼蓝中，然后上样。台盼蓝不能进入活细胞，所以计数时不要计数变暗变蓝的细胞。计数要记得乘以到台盼蓝的稀释倍数。如果有压线细胞，只记上线和左线上的细胞，不记下线和右线细胞。