细胞免疫荧光可以观察蛋白在细胞中的定位，以及一些特殊信号分子蛋白的出核/入核的定位变化，那么细胞免疫荧光实验怎么做呢？

　　在进行细胞免疫荧光过程中，需要用到细胞爬片，通过将爬片浸在细胞培养基内，细胞在爬片上生长，进而进行细胞的免疫荧光。

　　实验前准备：

　　1.胰酶

　　2.DMEM细胞培养基

　　3.细胞培养12孔板或者6孔板

　　4.爬片

　　实验步骤：

　　1．细胞种板与细胞爬片制备：

　　1) 细胞密度在90%-95%左右，用预热胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中，充分吹打，使之成单细胞悬液，计数。

　　2)取细胞培养12孔板，在每个孔放爬片的位置根据爬片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴几滴培养基，然后将爬片置于液滴上，压紧，使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，防止加细胞悬液时爬片漂起，造成双层细胞贴片。根据自己的需要选择合适的细胞密度种入12孔板培养板内。

　　3)24h或者48h后，根据细胞生长速度快慢，观察判断细胞密度，约90%时进行细胞免疫荧光。

　　2．细胞的固定及免疫荧光

　　1)吸除培养基，一般先加入PBS浸洗细胞 3 次，每次 5 min。

　　2)向孔内加入4%多聚甲醛1ml，进行细胞固定，室温固定20分钟。

　　3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。

　　4)向孔内加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室温通透20min，目的是使细胞通透。

　　5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。

　　6)用10%的与二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封闭2小时（选择的封闭液与后面操作过程中抗体稀释液一致）。封闭后不需要用PBS清洗。

　　7)吸去封闭液，向每孔滴加足够量适宜浓度的一抗（第一次使用抗体可以根据抗体说明书推荐浓度，后续实验可以摸索抗体的适宜浓度），4℃湿盒内孵育过夜。

　　8)吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。

　　9)向孔内滴加足够量适宜浓度的二抗，37℃，室温避光孵育1小时。注意二抗带有荧光素标记，因此操作过程尽量在暗处进行。

　　10)吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。

　　11)向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst复染细胞核，一般为蓝色荧光；避光孵育5-10min。

　　12)使用PBS轻洗细胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI。

　　13)取爬片时由于爬片与培养皿底结合较紧，张力较大，可将注射器针头针尖向背面做个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出即可。

　　14)用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，注意将爬片反过来贴于多聚赖氨酸载玻片上，然后在荧光显微镜下观察并采集图像，注意选择抗体对应的激发光源。

　　注意事项：

　　（1）取细胞爬片时，动作应轻柔，防止将细胞爬片夹碎，影响实验进程。

　　（2）种细胞过程中，要注意将细胞轻柔混匀，“八”字或者“十”字形摇晃，防止细胞局部生长过密。

　　（3）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光。

　　（4）细胞爬片进行免疫荧光之后，需要尽快拍照，防止免疫荧光淬灭。或者放于暗盒内，暂时保存于4度冰箱，尽快拍照。

　　（5）在进行荧光显微镜拍照时，要根据荧光抗体选择合适的激发光源。PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色，只在凋亡的细胞核中才有FITC-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光