一、前期保姆式准备，实验期间有备无患！

　　1. 实验仪器：移液枪、qPCR 仪要定期校准（较准周期一般是 1 年），保证仪器准确性。

　　2. 引物：引物设计后进行有效性验证，选取扩增效率在 90%～110% 之间，且融解曲线单峰的引物，保证其高效的扩增效率和特异性。

　　3. 内参：如何选择、如何验证？

　　选择：

　　（1）通过已发表文章查找相同物种的内参，在实验体系上进行测试；

　　（2）选择常见的内参，在实验体系上进行测试；

　　（3）内部控制基因（Internal Control Genes，ICG）库中查找内参。

　　验证：

　　（1）尽可能选用多个内参同时进行实验；

　　（2）通过在不同样本处理上的表达差异检测情况，来选择合适的内参，选择差异不显著的内参作为后续实验内参；

　　4. 样品 cDNA ：cDNA 模板需要稀释吗?应该稀释多少倍进行定量? 没有具体的稀释参考倍数，理论上 cDNA 每稀释 10 倍 CT 值变大

　　3.可以根据这个规律进行合适的稀释。可以使用 cDNA 原液、10 倍稀释液、100 倍稀释液等梯度稀释模板进行定量实验，根据规律选择 CT 值落在 18~28 范围内的稀释倍数。

　　二、提前排版 + 预混，准确加样不糊涂！

　　1. 实验目的：比较未处理（对照组）和经处理后（处理组）的样本中某基因的表达变化。

　　2. 实验分组与排板设计： 对照组和处理组除目的基因检测还需引入内参和 NTC（无模板阴性对照，用于排除实验体系中是否存在污染），每个处理做三个复孔。

　　加样小 tips：

　　①　加样环境：qPCR 实验反应灵敏度高，所以配置预混液的过程应均在超净工作台中进行，防止污染；

　　②　配置条件：预混试剂在冰上操作，并避免强光直射，减少体系配置过程中导致模板降解、酶活降低以及荧光淬灭的可能；

　　③　加样顺序：先加大体积，再加小体积液体；先加 NTC，再加模板。减小操作误差和污染风险；

　　④　加样方式： ➣ 小体积加样可以采取移液器二档吸液一档出液（也就是说按到底吸液，出液的时候不要按到底），若不进行枪头更换，下个孔就是一档吸一档打，这样可以提高加样精确度和复孔的重复度；

　　➣ 如果离心管已有液体了，再加小体积的时候，把枪伸到液面下打，可以避免液体在枪头内残留； ➣ 吸液体的时候枪头不要没入液面下太深，并选低吸附枪头，减少枪头吸附引起的误差。