一提到蛋白实验，大家想到最多的就是Western blot，其实除了WB，免疫荧光技术也是一项很好的检测蛋白定位和表达的辅助试验。

　　1、细胞密度

　　细胞密度是整个实验是否能成功的关键点之一。无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，爬片后细胞密度直接影响到后续的荧光拍照效果。

　　免疫荧光对细胞密度的要求不同于细胞划痕实验。我们在做细胞划痕的时候，一定要等到细胞长满才可以进行后续操作，但是免疫荧光并不需要这么多的细胞数量，镜下细胞太多反而会让图像效果很乱，没有针对性；如果细胞数量太多，产生叠加，也会影响整体荧光效果。

　　第一张图可能不是很清楚，玻片四周的细胞较多，中间的细胞较少。20倍镜下DAPI核染色可见细胞密度较大，其中亮度更显著的地方很可能是多层细胞叠加的效果。

　　那么我们该如何控制好细胞爬片时的密度呢？我们需要考虑的到爬片的尺寸和细胞生长时间。爬片是一个动词，其实就是将玻片放到培养皿中，让细胞在玻片上生长。

　　第一点：我们要保证玻片上的细胞以单细胞层生长。

　　在这一点上，个人认为悬浮细胞很容易被吹打混匀，玻片上的细胞基本上可以保证处于同一层面。但是贴壁细胞本身很喜欢抱团生长，所以镜下总是一簇一簇的细胞聚集，这种情况下就很难保证细胞生长同一层面了。那么我们在做这一步的时候，建议大家用10μl的小枪头吸取细胞悬液，在25mm的细胞爬片上从玻片外圈向内圈转圈加样（见下图），这么做相当于在缓慢加样的过程中，玻片上的细胞又完成了一次从外向内和从内向外的混匀过程，防止某一部位的细胞聚集。

　　加样结束后，镜下观察细胞初步密度。如果细胞密度过大，可以将玻片上的细胞悬液吸回再重新稀释；如果细胞密度可以，只是还存在部分细胞聚集，可以用5ml的注射器针头轻轻拨动细胞悬液，注射器针头相对于10μl的枪头还是细的，不会破坏细胞形态。

　　第二点：我们要考虑到细胞生长的速度。

　　正常细胞放在6cm的培养皿中，可能2-3天才会长满。但是爬片的面积本身较小，细胞在小面积的爬片上生长速度会更快一些，所以一般等到爬片上的细胞稳定后，再添加培养基于孵箱内培养12小时就可以了。如果时间超过24小时，即使最开始接种密度小，最后也会长得很满。

　　第三点：我们要保证爬片是无菌的。

　　从公司购买的爬片都是经过γ射线灭菌后用锡纸包装的，是可以直接使用的。使用之前在超净台下照一下紫外就可以了。然而实验中我们会发现，放置时间较长的爬片会经常黏连，很难分开。造成这种情况的原因多半是之前使用过的人没有把爬片封存好，接触到空气后，湿度较大造成的爬片黏连。我们在分离爬片的时候最好选用塑料材质的镊子（转膜时常用的那种材质），这样的镊子较软，一般不会将爬片捏碎。每次使用后记得用锡纸包裹好放回专门保存爬片的盒子中。其实只要保证使用后包裹严密，就不会造成黏连的情况。

　　2、孵育抗体

　　IF的抗体和WB的抗体并不都是能通用的，要看具体的购买厂家的说明书。一抗二抗的孵育条件和Western blot实验中大致相同，可以选择室温、4℃和37℃孵育一抗。不过大多数人还是习惯于4℃放置湿盒内孵育过夜，抗原抗体缓慢结合可以避免非特异性染色。但是如果选择4℃孵育过夜，一定要先恢复至室温后再用PBS清洗一抗，如果马上清洗很容易造成脱片。

　　我们在做WB的时候，首次会选择这个抗体的最高浓度去孵育，以便能发出清晰的条带。但是在做IF的时候，如果抗体的浓度过高，会让后续图像曝光效果过亮或者荧光定位有偏差，所以建议大家首次做IF时，可以根据抗体说明书选择一个中间浓度孵育。

　　如图所示的免疫荧光图片，看似结果很漂亮。可是本人要检测的蛋白是一个细胞膜标志性蛋白，但是图中的效果似乎胞质和细胞核染色更为明显。遇到这种似乎是目的蛋白定位偏差的情况，可能的原因：

　　1、一抗浓度过高；

　　2、一抗孵育之后洗涤不充分；

　　3、一抗特异性不高，这时候你要考虑这个蛋白是细胞本身就表达的还是转入的质粒表达的；

　　4、可以查一下抗体识别序列，看看是否有同源性的蛋白。

　　就像跑WB的时候，某些蛋白总是会跑出两条条带一样，可能你这个目的蛋白的某个同源性蛋白会结合细胞的其他部位，虽然厂家在生产抗体的时候一般不会有这种问题，但是如果修改了实验步骤的所有条件后，仍然定位不准确，你可以考虑一下第3/4两点。

　　二抗室温孵育1小时就可以了。注意封闭液和一抗是可以回收的，二抗是不能重复利用的。

　　3、DAPI复染细胞核

　　建议DAPI现用现配，而且不用染色太长时间。如果你的试剂是新配制的，避光复染2-3分钟就足够了。用PBS清洗玻片的时候，也建议在避光环境下清洗。因为DAPI本身发蓝光，如果蓝光太强，荧光显微镜会将蓝光显示成绿光，影响结果分析。

　　4、封片

　　滴加封片剂的时候，要将有细胞的一面朝下放置。可以选择抗荧光淬灭的封片剂也可以选择甘油封片。日常实验中，如果你不需要等很长时间才可以观察结果，或者不需要后续重复观察，也可以不用封片，立即镜检。

　　滴加封片剂的时候只需要在载玻片的中心位置滴加一滴就好，差不多5μl左右的量就可以了。然后把有细胞的面朝下贴在载玻片上，注意不要产生气泡。

　　如果封片剂滴加过多，那你的细胞荧光就会被完全覆盖住，什么都看不到了。

　　总结一下个人认为影响实验效果的关键点：

　　1、清楚蛋白定位和预测蛋白表达；

　　2、细胞爬片时的密度；

　　3、一抗浓度和特异性好坏；

　　4、如果涉及到双标染色，切记要将两种蛋白的种属来源区分开，二抗的颜色也要区分开；

　　5、DAPI复染时间；

　　6、细胞免疫荧光最好不封片，新手很容易在最后一步功亏一篑；

　　7、如果要观察时间梯度的变化，尽量不用一次性观察好几个时间组，一次只观察1-2组，不会影响荧光效果。