细胞复苏是一简单的试验操作，但操作中有许多需要注意的事项，在实验操作中注意细小问题，才能使复苏后的细胞状态保持良好。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。细胞复苏可以用于生物学保种、医学上干细胞研究和传代培养。

　　细胞复苏实验所需材料：

　　1. 仪器：净化工作台、 离心机、恒温水浴箱、冰箱(4℃、-20℃、-70℃)、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱。

　　2. 玻璃器皿：吸管(弯头、直头)、 培养瓶、玻璃瓶(250ml、100ml)、废液缸。

　　3. 塑料器皿： 吸头、枪头、胶塞、移液管(10ml)、15ml离心管、冻存管(1～2ml)。

　　4. 其他物品：微量加样枪、红血球计数板、记号笔、医用橡皮膏、移液枪。

　　5. 试剂：D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗(青霉素、链霉素)、胰蛋白酶(0.08%)、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油。

　　细胞复苏实验步骤：

　　1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

　　2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。

　　3. 离心， 1 000 rpm，5 min。

　　4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养。

　　5. 次日更换一次培养液，继续培养。

　　细胞复苏实验注意事项：

　　1、注意无菌操作。

　　2、应在1-2min内使冻存液完全融化。如果复温速度太慢，则会造成细胞损伤。另外，细胞复苏后的操作最好在4℃冰浴中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。

　　3、细胞复苏过程中，升温的速率要大，把从液氮或-70℃水箱中取出的细胞在最短的时间内放入水浴锅。

　　4、细胞放入水浴中注意用镊子夹住细胞冻存管并在水浴中不时晃动，使其受热均匀，并防止水浴时水进入细胞冻存管污染细胞。打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。

　　5、液氮操作有一定的危险性，打开液氮罐取出细胞时，戴上防护眼睛。

　　6、如果冻存管密封不严，液氮可被吸入。由于解冻时冻存管中的气温急剧上升，将可能发生爆炸。复苏过程中应盖上恒温水浴锅的盖。

　　细胞复苏后贴壁细胞较少的原因有哪些：

　　1.冻存细胞的时候是不是消化时间过长，这是一般人注意不到的地方，要知道太长的消化时间会使细胞复苏时失去贴壁能力。

　　2.有可能是细胞冻存液的质量，细胞冻存液的质量不好也会导致细胞死亡。

　　3.冻存液的量加的是不是太多，ATCC推荐是不超过7%，大于5%，太多也不好。

　　4.冻存的时候是不是把DMSO混均匀，这个有一些影响，但不算太大。

　　5.冻存时温度梯度是不是把握严格，很多人容易忘却这个事情，因为这个东西流程长。

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