细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

　　一、细胞培养前期准备工作

　　细胞培养仪器设备：

　　· 细胞培养通风橱（即生物安全柜）

　　· 培养箱（通用推荐：湿式二氧化碳培养箱）

　　· 离心机

　　· 医用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低温冰箱（-80℃）、液氮冷冻罐

　　· 倒置显微镜

　　其他用品：细胞培养容器（培养瓶、培养皿、多孔板等），吸管和移液器，培养基、血清和试剂

　　注意事项：

　　· 无菌工作区域：细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区域处于无菌状态，最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。

　　· 无菌试剂和培养基：商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌，注意操作过程中不要被污染，其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法（例如：高压蒸汽、无菌过滤等）进行灭菌。

　　· 无菌操作：要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75%酒精消毒；尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作，避免交叉污染；试剂瓶和培养用具使用时方可开盖，用后要第一时间盖上，暴露于环境中的时间尽可能要短。

　　· 整体的细胞实验环境也弥足重要，需要定期对实验室环境进行较为彻底的清扫消毒和杀菌，包括实验用仪器和室内地面、桌面等。

　　二、细胞的复苏与冻存

　　细胞复苏：

　　1. 在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下，需要进行细胞复苏：

　　2. 从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后，快速转移至37℃水浴条件下轻轻转动融化（一分钟内）。

　　3. 75%酒精擦拭冻存管外部后，转移至通风橱中。

　　4. 加入适量新鲜的完全培养基混合，约800-1000rpm下离心5-10分钟，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。

　　5. 新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中，做好标记，37℃，5%CO2条件下培养。

　　细胞冻存：

　　1. 为现有细胞系做细胞储备，需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存：

　　2. 准备细胞冻存液，置于2℃-8℃下备用。

　　观察待冻存的细胞，密度达到80%-90%左右，将贴壁/悬浮细胞分别按照传代方法收集。

　　3. 使用血球计数板对细胞密度进行大致估算后，计算出冻存溶液的体积，从而保证单支冻存细胞有足够的细胞量用于复苏。

　　4. 约800-1000rpm下离心5-10分钟，无菌条件下小心弃去培养基，不要搅动细胞沉淀。

　　5. 用合适体积的预冷后冻存液重新混悬细胞沉淀，分装至冻存管中，做好标记后进行梯度降温至液氮环境中保存，入库。

　　★★★对于传统的细胞冻存，需要进行程序降温（4℃→-20℃→-80℃→液氮）冻存，为避免操作流程的繁琐不可控，可选用无血清非程序降温细胞冻存液，包括Cellregen无血清细胞冻存液和无血清低DMSO细胞冻存液。两种细胞冻存液均有无血清、无动物源蛋白、非程序降温的特点，可直接放置-80℃冰箱冻存。Cellregen无血清细胞冻存液已经得到了市场广泛认可，用户遍布全国科研院所、大学、医院和企业。无血清低DMSO细胞冻存液是新开发的更加低毒、高效的冻存液产品，为客户提供更多选择。

冻存液对比表

　　注意事项：

　　· 细胞的复苏中，如细胞对温度比较敏感，可将生长培养基预热至37℃后再加入融化后的细胞冻存液中混匀。

　　· 将复苏的细胞高密度接种，如两支冻存细胞接种到一个孔板中，可有效提高复苏效率。

　　· 细胞冻存，在加入冻存液进行分装的过程中，要不时轻轻混合细胞，使其保持均匀的细胞悬液状态，更有利于保证细胞的冻存效果。

　　三、细胞传代

　　贴壁细胞传代流程：

　　1. 当培养贴壁细胞密度达到80%左右即可细胞的传代操作，从培养器皿中吸弃原有的细胞生长培养基。

　　2. 使用不含钙镁离子的平衡盐溶液轻轻润洗细胞（缓冲液用量根据培养器皿的表面积调整），避免搅动细胞，前后轻晃动器皿数次。

　　3. 吸弃缓冲液，重复润洗一次。

　　4. 向培养器皿中加入适量的预热解离剂（如胰蛋白酶等），充分覆盖细胞层，轻轻晃动容器数次。

　　5. 将培养器皿在室温下孵育2-5分钟。实际孵育时间实际根据细胞系的种类不同而定。6. 移至倒置显微镜下观察细胞解离情况，可轻轻拍打器皿壁沿以加快细胞解离。

　　7. 当细胞解离程度大于90%，加入三倍于解离液体积的生长培养基中止解离过程，轻轻晃动后吹打细胞，收集至无菌离心管中。

　　8. 约800-1000rpm下离心5-10min，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。

　　9. 弃去含解离剂的上清溶液，用最少体积的生长培养基重悬细胞沉淀，混匀后取出少量使用血球计数板计算细胞数量。

　　10. 将细胞悬液稀释到该细胞系推荐的接种密度，并将适量体积的细胞悬液转移至新的细胞培养器皿中放回培养箱。

　　悬浮细胞传代流程：

　　1. 当细胞生长至适合传代（即处于对数生长期而未达到聚合的状态）时，从培养瓶中吸取出少量的细胞样品，如有细胞已部分沉淀，要先轻轻晃动培养瓶使细胞处于均匀的悬浮状态后再取样。

　　2. 使用血球计数板对细胞进行计数。

　　3. 计算将细胞稀释到推荐接种密度所需要的加入的培养基体积，如有必要，可先对培养瓶中细胞进行离心收集（800-1000rpm、5-10min）后再重悬计数和接种。

　　4. 在无菌状态下将适量预热的生长培养基加入培养瓶中，必要时可将培养的细胞分散接种到多个培养瓶中。

　　5. 将培养瓶的旋盖外旋一圈，便于进行充分的气体交换（或者使用透气性瓶盖），并将培养瓶放回培养箱中继续培养。

　　注意事项：

　　· 贴壁细胞在进行解离（消化）过程中，如果室温下效果不理想，可转移至37℃培养箱中加快该过程，但要注意控制时间，每30秒需要镜检一次。

　　· 细胞在缓冲液润洗过程中要尽量完全彻底，培养液中的血清残留会影响消化效果。

　　· 为了减少细胞碎片和无用的代谢副产物在培养液中累积，每三周或者必要时都应将悬浮细胞收集起来进行一次离心重悬再接种，具体操作等同于正常的传代培养。

　　· 通常情况下，悬浮细胞培养中所需添加特定的生长依赖因子，尽量按照“现用现添加”的原则，从而保证培养基中该物质的浓度足够满足细胞的生长需求。

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