RT-PCR的原理是提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

　　该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

　　RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求：

　　1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

　　2. RT按要求做，一般不会出太大问题。

　　3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2 浓度、退火温度能解决的。

　　RT-PCR技术操作步骤：

　　1、预变性：

　　破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。

　　2、变性--退火--延伸循环：

　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备;

　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

　　3、PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟。

　　注意事项：

　　1、合成cDNA的引物：合成cDNA引物时，通常采用随机六核苷酸引物能够有效地指导从RNA有效地合成第一链cDNA：

　　2、避免RNA酶的污染：在合成cDNA第一链时，应使用RNA酶抑制剂，进行RT-PCR时，用于合成cDNA第一链的RNA不会对PCR有影响，因此没有必要用碱或RNA酶处理;

　　3、不同来源的逆转录酶均可较好地用于第一链cDNA的合成，但不同来源的逆转录酶反应温度有所不同。如来自鸟类成髓细胞瘤病毒(AMV)与来自鼠白血病毒莫勒尼株(Mo-MLV)均可用于合成第一链cDNA，AMV要求的反转录温度为42℃，而Mo-MLV则要求37℃，相对而言，Mo-MLV比较适合于RT-PCR，但由于其作用的最适温度为37℃，较AMV的42℃低，因此，对于具有较高二级结构的RNA模板可能会带来不利的影响。