在做PCR反应实验的时候，你是否遇到一些难以解决的问题？不知道Tm值的计算方法是怎么样的？不清楚PCR用引物的使用量?不了解简并性引物对PCR扩增有无影响?

　　PCR (Polymerase Chain Reaction) 法是一种体外扩增DNA的方法。通过以下三个步骤：

　　DNA链的热变性 (Denaturation step)

　　引物退火 (Annealing step)

　　聚合酶作用下引物的延伸 (Extension step)

　　循环往复，可在短时间内扩增DNA达105倍以上。TaKaRa Taq 是一种94 kDa的高纯度耐热性DNA聚合酶，是把Thermus aquaticus YT-1株的DNA polymerase基因在大肠杆菌中表达后，分离提取得到的，与野生型DNA polymerase具有相同的功能。

　　Step 1：在含有引物、dNTP及DNA聚合酶的反应液中双链DNA热变性 (94℃、30 sec)

　　Step 2：引物与热变性生成的单链DNA退火 (55℃、30 sec)

　　Step 3：在DNA聚合酶作用下合成互补链 (72℃、1 min)

　　Step 4：扩增的双链DNA再次热变性生成单链DNA (返回Step 1)

　　Step1～4称为一个循环，如此循环往复25～30次。

　　注：不同的DNA片段要达到最高的扩增效率，需要设定不同的反应条件。

　　设计PCR用引物时的注意事项，可以从以下几个方面考虑。

　　1. 引物长度通常为20～25 mer。但进行LA PCR时，引物长度应增长为30～35 mer。

　　2. 二条引物之间不能进行Annealing，对3′端的3个碱基需特别注意。

　　3. GC含量在50～60%，避开局部富含GC或AT，为了使引物和模板稳定结合，3′端应避开AT rich结构。

　　4. 避开引物自身形成二级结构。

　　5. 选择Tm温度相互接近的二条引物。

　　PCR引物Tm值计算方法是怎么样的?

　　1、PCR用引物的Tm值的计算方法?

　　引物为20 mer以下时：

　　Tm = 2℃×(A+T) + 4℃×(G+C)

　　引物为20 mer以上时：

　　Tm = 81.5 + 0.41×(GC%) - 600/L

　　其中L为引物的长度。

　　在PCR反应过程中选择Annealing温度时，一般为 (Tm - 5)℃。

　　2、设计PCR用引物时的注意事项?

　　可以从以下几个方面考虑。

　　1. 引物长度通常为20～25 mer。但进行LA PCR时，引物长度应增长为30～35 mer。

　　2. 二条引物之间不能进行Annealing，对3′端的3个碱基需特别注意。

　　3. GC含量在50～60%，避开局部富含GC或AT，为了使引物和模板稳定结合，3′端应避开AT rich结构。

　　4. 避开引物自身形成二级结构。

　　5. 选择Tm温度相互接近的二条引物。

　　3、PCR用引物中含有Inosine (次黄苷) 碱基，其Tm值怎样计算?

　　可以不考虑Inosine碱基，使用A、G、C、T计算Tm值就可以。

　　4、PCR用引物的使用量?

　　合适的终浓度可在0.1 μM～1.0 μM之间选择。引物的浓度太低时，有时扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容易出现非特异性扩增反应。通常模板DNA的量较多或High complexity DNA (例如Human genome DNA) 作模板时，引物浓度应低一些；当模板DNA的量较少或Low complexity DNA (例如Plasmid等) 作模板时，引物浓度应高一些。

　　5、简并性引物对PCR扩增有无影响?

　　有影响。简并数量应尽量少。

　　通常一条引物中简并的碱基不要超过4处，如果简并的碱基数过多，则会造成反应体系中有效引物的量相对减少，此时应适当增加引物的使用量。但引物量过大，容易引起非特异扩增，应加以注意。

　　6、50 μl PCR反应体系中Template的加入量?

　　50 μl PCR反应体系中模板DNA推荐使用量：

　　7、PCR产物 (3‘端附有A碱基时) 经末端平滑后，克隆于去磷酸的平滑末端载体时，其PCR产物需不需要5′末端磷酸化?

　　需要。一般的PCR用引物5′末端都不带磷 (除非在引物合成时已特别标记)。使用这种引物进行PCR的PCR产物经末端平滑化后，与去磷酸的平滑末端载体连接之前，PCR产物必须进行5′末端磷酸化。

　　8、PCR产物需用限制酶进行消化时，需不需要进行Buffer交换?

　　在通常情况下，首先须把PCR产物进行纯化后再进行限制酶的酶切反应。但如果只使用PCR反应液的一部分(1～5 μl) 进行酶切反应时，可以不经纯化使用限制酶进行20 μl体系的酶切反应。