PCR是众所周知的分子生物学技术之一。20世纪70年代，研究人员首次报道了使用合成引物和DNA聚合酶从模板复制单链DNA。然而直到1983年，Kary Mullis才发明出用于扩增目标DNA的研究工具，就是我们今天所熟知的PCR方法。从此以后，PCR成为分子生物学研究必不可少的一部分，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。

　　pcr可用于哪些领域？

　　1. 基因表达

　　通常可通过PCR来检测不同细胞类型、组织和生物体在特定时间点的基因表达差异。首先，从目标样品中分离出RNA并将mRNA逆转录成cDNA。随后，通过由PCR扩增的cDNA数量，确定mRNA的初始水平。这一过程也被称为逆转录PCR， RT-PCR

　　终点PCR 可通过凝胶里的扩增产物条带强度对RNA的表达进行定量（一种半定量方法）。例如，对起始cDNA进行连续稀释并扩增。通过凝胶电泳使不同起始量的终点PCR得率可视化，然后对条带强度进行定量，并以管家基因为参照进行标准化，预估扩增靶点的相对表达水平[1] [2]。如今，终点PCR已基本被实时PCR 或qPCR 取代了，因为它们可获得更可靠和更准确的基因表达定量结果。

　　2. 基因分型

　　PCR可用于检测特定细胞或生物体中等位基因的序列差异。例如，基因敲除和敲入小鼠等转基因生物的基因分型[3]。引物对经设计位于目标区域侧翼，可根据是否存在扩增子及扩增子长度来检测遗传变异

　　但是如果为了检测特定核苷酸突变，则必须对扩增的序列进行进一步分析。例如， PCR扩增子测序就是研究单核苷酸变异（SNVs）和单核苷酸多态性（SNP）的方法之一。强烈推荐使用高保真DNA聚合酶，以防止在PCR过程中引入多余的突变。

　　通过PCR进行基因分型也是对癌症和遗传病中的 突变进行遗传分析的一个基本方式。

　　3. 分子克隆

　　PCR被广泛应用于目标DNA片段的克隆，该技术被称为 PCR 克隆。在直接PCR克隆中，DNA（如，gDNA、cDNA、质粒DNA）的目标区域被扩增并插入到特殊设计的兼容载体中。

　　PCR克隆：通过PCR制备的插入片段被克隆到兼容载体中。(A) 直接PCR克隆技术包括TA和平端克隆。(B) 间接PCR克隆，扩增子可在插入到兼容载体之前被修饰，如进行限制性酶切

　　除了制备插入片段，PCR也是一种在在克隆后筛选克隆是否携带目标插入片段的有效方法。引物经过设计，可以用于确定载体中插入片段是否存在和插入方向。

　　4. 突变

　　PCR克隆的一大优点是能够通过克隆将所需突变引入目的基因中，以便进行突变研究。在 定点突变中，经过设计的PCR引物可将碱基置换、删除或插入整合到特定序列中。引物定位到已克隆至质粒中的序列上。随后，含有引入突变的PCR产物通过自我连接，重新生成环状质粒，并用于转化感受态细胞。

　　5. 甲基化

　　PCR可用于研究位点特异性甲基化。在 甲基化特异性PCR（MSP）方法中，设计了两个引物对，以区分目标位点的甲基化状态[7][8]。

　　首先使用重亚硫酸盐处理DNA样品，将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）。重亚硫酸盐处理不会影响甲基化的胞嘧啶(m5C) 。为了检测甲基化位点，一对引物经设计 带有 鸟嘌呤（G），可与目标序列中的 m5C 配对；为了检测未甲基化位点，另一对引物带有腺嘌呤（A），可与重亚硫酸盐转化分子中的U配对（随后，与后续PCR循环中的胸腺嘧啶（T）配对）。通过引物配对得到的阳性PCR扩增结果可用于确定位点的甲基化状态。

　　甲基化研究中所使用的DNA聚合酶除了能够扩增富含AT的序列，还必须能够读取识别重亚硫酸盐处理后DNA中的U残基。而高保真DNA聚合酶含有来自于古细菌起源的尿嘧啶结合域，所以不适用于MSP（除非经过特殊修饰）。

　　实时PCR 可代替终点PCR，为MSP提供更准确的甲基化定量分析。利用实时PCR，对PCR扩增子的熔解曲线分析是检测目标位点甲基化状态的一种替代性PCR方法。

　　6. 测序

　　PCR是为测序富集模板DNA的一种相对简单的方法。为保证DNA序列准确性，强烈建议使用高保真PCR来制备测序模板。

　　在 Sanger测序中，PCR扩增片段经纯化并用于测序反应。使用常用的测序引物结合位点（如M13或T7“通用引物”结合位点）对PCR引物的 5′末端进行标记，以简化测序工作流程。

　　二代测序 （NGS）中，PCR被广泛用于构建DNA测序文库。在NGS文库制备中，DNA样品通过PCR反应富集（在起始量有限的情况下）并使用adaptor（以及用于多重检测的index）标记。除了具有高保真度，DNA聚合酶还应具有最小的扩增偏好性，从而使测序文库具有高覆盖度。

　　7. 医学、法医学和应用科学

　　PCR技术不仅可用于基础研究，还适用于日常的临床诊断、法医学调查和农业生物技术研究。这些应用要求可靠的性能、卓越的灵敏度和严格的标准。因此，所使用的PCR仪和PCR试剂必须符合这些要求和目的。

　　分子诊断应用包括基因检测、致癌突变检测以及感染性疾病检测。在法医学中，利用 PCR进行人类身份鉴定是通过对独特的短串联重复序列（STR）进行扩增而区分个体的。在农业学中，PCR在食物病原体检测、育种植物基因分型和 GMO测试中具有重要作用。