降落PCR简介

　　降落PCR（touchdown PCR）是一种优化PCR条件的技术，一般用于在复杂模板中提高扩增特异性，但值得注意的是降落PCR无法解决扩增效率低的问题。

　　我们知道从复杂的DNA模板通过PCR扩增基因会受到许多因素的影响，这些因素主要包括循环次数、Mg2+、H+、dNTP、引物和模板等。而这每一个因素对于每个PCR反应都有一个最合适的值，一般来说从一个方向改变某个数值有利于特异性提高，当这个值接近最适值时,特异产物产量会发生减少；从相反的方向改变参数值,有利于增加产量,但是特异性降低。如果想找到一个合适的PCR参数，则需要花费大量的功夫。降落PCR，对于PCR条件的优化只集中在一个参数即退火温度上，并且一个程序中可以采用不同的退火温度。

　　这种技术是在1991年，有Dn最早发明的,指每一个(或n个)循环降低1(或nC)退火温度,直至达到一个较低的退火温度,这个温度称为“ touchdown”退火温度,然后以此退火温度进行10个左右的循环。据统计,正确和非正确退火温度之间的1差异将造成FR产物量的4倍差异,如果相差5,就会产生42(1024)倍的优势,因此相对于非正确产物,正确的产物可以得到富集。退火温度起始在高于计算的T值的15左右,在接下来的循环中,退火温度以每次12逐渐降低,直到T值以下5,当达到特异的引物模板结合的T值时,扩增就会开始。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时,特异产物会有一个几何级数的起始优势,在剩余反应中,特异产物优先扩增,从而产生单一的占主导地位的扩增产物。这种方法主要用于避免非特异PCR产物的出现,尤其是当使用复杂的基因组DNA模板,非特异的退火更容易发生时。

　　降落PCR中正确的产物得到富集,原理在于温度的升高提高了PCR扩增的特异性,但也提高了引物结合的难度,降低了扩增的效率,因此一开始先用高温扩增,保证扩增的严紧性,待目的基因的丰度上升后,降低扩增的温度,提高扩增的效率(此时非特异的位点由于丰度低,无法和特异位点竞争)。

　　降落PCR实验步骤

　　1.实验材料：基因样品

　　2.实验仪器：PCR仪

　　3.实验步骤：

　　①反应体积为50 μl。

　　②人CD137胞膜外区基因的PCR扩增体系：CD137-pCDNA3质粒4 μl，P1，P2各0.5 μmol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。

　　③hIgG1Fc片段的PCR扩增体系：含人hIgG1Fc的PGEM-T质粒4 μl，P3、P4各0.4 μmol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。

　　④HBVDNA多聚酶基因的PCR扩增体系：

　　（1）第一轮：HBVDNA模板4 μl，P5、P6各0.25 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U.

　　（2）第二轮：取5倍稀释的第一轮PCR产物4μl为模板，P7、P8各0.25 μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U。

　　⑤分别在各灭菌PCR管加入上述各反应成分，100℃煮沸5 min，立即冰浴5 min，加入TaqDNA聚合酶，混匀，离心，PCR程序如下：