荧光定量pcr是一种相对准确的定量pcr的方法，可用于mRNA 、MicroRNA、circRNA、lncRNA等表达量分析。

　　本文介绍了荧光定量PCR实验过程中引物设计原则、探针设计原则、引物退火温度、模板浓度、残余污染等各个方面的一些细节对荧光定量PCR实验结果的影响，掌握这些知识将有助于我们做好荧光定量PCR实验。

　　相关实验资料：荧光定量PCR（Real Time PCR）原理及用途

　　如何做好荧光定量PCR？以下这些知识你要知道！

　　1.目的基因的查找和比对

　　目的基因一般由NCBI数据库查询可靠的序列，在此不做过多叙述。

　　2.引物和探针设计

　　引物设计原则：

　　a) 引物与模板序列要遵从紧密互补的原则

　　b) 引物相互之间应避免形成稳定的二聚体或发夹结构

　　c) 在模板的非目的位点，引物不能引发DNA错配现象

　　d) 引物长度更适合在20-25bp之间，Tm值在55-65℃，CG含量应在40%-60%，产物大小应在100-250bp之间

　　e) 引物3’端应避免出现3个连续碱基；引物3’端避免使用碱基A

　　f) 跨内含子设计引物（跨两个为宜）

　　探针设计原则：

　　1) 探针位置尽可能靠近上游引物

　　2) 探针的5’端应避免使用碱基G

　　3) 整条探针中碱基C的含量要明显高于碱基G

　　4) 探针长度通常在20-30bp，Tm值在65-70℃（通常比引物高5-10℃），CG含量应在40%-70%

　　为了更高效的设计出适合用于荧光定量PCR的引物和探针，我们可以使用引物设计软件。因为大多数引物设计软件均包含引物/探针的Tm值、互补性、二级结构以及扩增子大小等重要因素的可调节参数。

　　3.引物退火温度

　　引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

　　设定Tm有几种公式。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。大部分计算机程序使用近邻分析法——从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。所有oligo软件会自动计算引物的Tm值。在设置退火温度时可以如下进行：以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得zui佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

　　4.引物浓度

　　引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过Beers法则（公式1）计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式2计算。与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短，碱基组成差异很大。在oligo软件上可以计算出引物的的消光系数（OD/μmol）和消光系数的倒数（μmol/OD）。

　　一般商业合成的引物以O.D.值表示量的多少，在一般情况下，20个碱基长的引物，1个O.D.加100ul水后引物浓度为50pmol/ul（50μM）。也可以用OLIGO软件，根据引物的的消光系数（OD/μmol），计算出一定的工作浓度下，引物的加水量。

　　浓度（μM）＝A260（OD/ml）×稀释系数×消光系数的倒数（nmol/OD）

　　举例：计算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10μl稀释100倍（加入990μl）水中。在A260处测吸光度为0.2。计算消光系数的倒数为4.8 nmol/OD，代入得：

　　浓度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM

　　5.引物、探针的纯度和稳定性

　　定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100％。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3"到5"合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。

　　引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。也可以用双蒸水溶解。

　　引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。

　　探针即寡核苷酸进行荧光基团的标记，标记本身有效率的区别。探针标记以后一般应该纯化，纯度高、标记效率高的探针不仅荧光值高，且保存时间可以高达一年以上。不同的生物技术公司探针标记效率和纯度有很大的区别。

　　由于反复冻融易导致探针降解，在确认探针质量好的情况下，最好稀释成2uM（10×），作为工作浓度分装多支，避光保存。

　　6.热启动

　　热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。

　　限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。

　　热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。像手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。

　　7.镁离子浓度

　　镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。zui佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液（普通PCR是1.5mM）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，普通PCR从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用Taq酶。

　　8.模板质量

　　模板的质量会影响产量。DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。分离基因组DNA较新的方法包括了DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存DNA。应注意进行PCR反应的模板质量，以增加PCR 反应的成功率。

　　9.模板浓度

　　起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数PCR扩增和荧光PCR扩增，104到106个起始目的分子就足以观测到好的荧光曲线（或在溴化乙锭染色胶上观察到）。所需的zui佳模板量取决于基因组的大小（下表）。举例说，100ng到1μg的人类基因组DNA，相当于3×104到3×105个分子，足以检测到单拷贝基因的PCR产物。质粒DNA比较小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg级的。对于一般的检测样品，10－100ng的量就足够检测了。当然对模板做一个梯度稀释，对于定量PCR而言是非常容易，且能分析扩增效率。

　　基因组大小和分子数目的比例：