在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化检测产物量的变化，最终得到得到一条荧光扩增曲线图，扩增曲线横坐标表示循环数，纵坐标表示荧光强度。

图1：qPCR扩增曲线

　　一般而言，荧光扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期）、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化；在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的PCR产物量也不能计算出起始DNA拷贝数；只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。

　　荧光定量PCR常用术语

　　在了解荧光定量PCR如何对初始模板进行定量之前，需要了解几个在荧光定量PCR分析中常用的术语：

　　基线：实时荧光定量PCR反应的基线是指在PCR的最初几个循环中（一般为3-15个循环）的信号水平。此阶段的荧光信号变化量极小。低水平的基线信号相当于反应的背景或噪声。每个实时荧光定量PCR反应的基线应通过用户分析或扩增曲线自动分析，根据经验确定。基线的设置，会影响到荧光阈值及Ct值。

　　荧光阈值：荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值默认是PCR 3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍。

　　Ct值：Ct值指的是PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环数。

　　标准曲线：标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系。对已知拷贝数的标准样品做系列稀释，对不同稀释度的标准样品进行荧光定量PCR并记录Ct值，根据Ct值及拷贝数的对数绘制得到标准曲线，标准曲线的纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代Ct值。

　　如何实现对初始模板的定量

　　利用实时荧光定量PCR对样品的初始模板量进行定量分析，需要利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，再通过荧光定量PCR获得未知样品的Ct值，最后从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

图2：对初始模板进行定量分析

　　标准曲线绘制

　　标准品的制备

　　设计特定引物，利用PCR对目的基因片段进行扩增，随后将目的基因片段克隆至载体中，测序验证是否为阳性重组质粒，最后收集阳性克隆质粒作为标准品。

　　绘制标准曲线

　　测定质粒的浓度，依据公式计算出质粒的拷贝数。对质粒进行系列稀释，分别作为模板进行荧光定量PCR并记录Ct值。最后依据起始拷贝数的对数及Ct值绘制标准曲线，得到标准方程。当需要对起始模板进行定量时，只需要得到扩增曲线，读得Ct值，带入标准方程即可对起始模板定量。