单细胞的多重免疫荧光生物成像及其在组织中的空间组织为未来精准诊断和治疗的发展提供了广阔的前景。当前的多路复用管道通常涉及跨多个组织载玻片的多轮免疫荧光染色。这引入了可以隐藏潜在生物信号的实验批次效应。重要的是要有强大的算法来校正批次效应，同时不会将偏差引入数据。数据归一化方法的性能可能因不同的分析管道而异。为了评估差异，拥有一个代表分析的基本事实数据集至关重要。

　　生物图像标准化工作流程概述

　　将原始免疫荧光生物图像转化为定量生物特征是一个多步骤过程，通常涉及标准化步骤以校正系统误差（即批次效应）和同一载玻片之间和图像之间的偏移。图1介绍了生物成像工作流程步骤，包括原始图像的预处理、将图像中的像素聚合为对象、根据质量指标过滤对象、跨载玻片标准化对象、校正图像，最后将校正后的图像分割成生物学相关特征以进行下游分析。原始图像预处理包括视野 (FOV) 照明校正、失真校正、多轮染色和成像的图像配准以及自体荧光去除。这些预处理步骤中的每一个都可能将系统误差引入到来自组织载玻片制备、染色和显微镜成像过程步骤的那些之上的载玻片图像中。

　　跨虚拟载玻片标准化生物图像和生物特征强度的工作流程概述

图 1

说明了两个标准化工作流程在原始 MxIF 图像经过预处理后进行：分段对象工作流程和基于网格的对象工作流程。两种工作流程都从将单个像素聚合到对象中开始。对象的强度值定义为对象内包含的像素强度的平均值。分割对象归一化工作流程使用一个或多个图像通道（例如核染色强度，如 DAPI）来描绘对象并因此将像素分类为属于特定对象或所有对象外部（即背景）。基于网格的方法将所有图像像素聚合到由规则间隔网格定义的网格对象中。网格大小的范围可以从一个像素的大小到将整个图像的所有像素聚合到一个网格中。

　　基于网格的对象工作流程是无偏见的，并且不排除与分割对象工作流程不同的生物图像区域。抗原目标的免疫荧光染色根据实际蛋白质表达分布，不一定限于分段对象。另一个主要区别是，跨染色通道标准化生物图像的步骤发生在基于网格的对象工作流将像素分割成单元对象之前。两个工作流程之间的第三个区别是，每个生物图像的分割对象数量可能会因组织和细胞密度的变化而变化，而基于网格的对象工作流程将在所有生物图像中具有恒定数量的对象。

　　在两个标准化工作流程结束时进行评估步骤（图 1 中的右侧））。这一步是我们在评估和比较多种归一化方法时进行基准测试的主要目标。我们为此评估步骤开发了一种方法，该方法利用基于真实 DAPI 染色和成像数据的虚拟载玻片以及量化误差的度量。这使我们能够根据经验基础事实与理论上得出的事实来判断每种方法和标准化工作流程。DAPI 被选为评估标准化工作流程的标记，因为组织载玻片的 DAPI 染色在 MxIF 工作流程的每一轮中反复刷新和重新成像。DAPI 是一个非常有用的标记，用于图像配准和访问是否在所有轮次染色和成像中都存在相同的底层核结构。

　　2.2 组织样本和生物图像的生成

　　有关组织样本和生物图像生成的完整详细信息，包括 MxIF 工作流程中的每一轮染色和成像（补充表 S1 和 S2）可在补充材料，但简要说明：来自爱尔兰都柏林的 Beaumont 医院/RCSI、北爱尔兰贝尔法斯特女王大学和法国巴黎的巴黎笛卡尔大学的未鉴定 III 期结肠直肠癌 (CRC) 患者的组织样本。构建了三个组织微阵列(TMA) 块，包括79 个患者肿瘤核心和6 个福尔马林固定、石蜡包埋的细胞团(即细胞系)。福尔马林固定、石蜡包埋的细胞系（HeLa、HCT116 XIAP-KO、MCF7、JURKAT）包含在三个 TMA 中。TMA 载玻片在 GE 全球研究中心接受了多重免疫荧光 (MxIF) 显微镜检查。先前已经描述了多重显微镜技术和单细胞分析的详细描述（ Gerdes，2013）。本文使用的平台（Cell DIVE TM, Leica Microsystem) 允许对单个组织切片上的 60 多种生物标志物进行迭代染色、成像（在 IN Cell 2200 上）和化学染料灭活工作流程，自动校准脚本提供客观对中和聚焦、空白玻璃减法、失真校正和场展平。图像的后处理包括自发荧光减法、使用基线 DAPI 配准和区域拼接。TMA 用 24 种生物标志物染色（迭代染色步骤，每轮染色两种生物标志物），包括凋亡途径标志物 BAK、BAX、BCL2、Bclxl、SMAC、XIAP、APAF、Caspase 和 MCL1；免疫细胞/反应标志物：CD3、CD4、CD8、CD45、FOXP3、PD1、HLA1；上皮细胞标志物：PCK26、NaKATPase、细胞质 S6 和功能标志物：CA9、Glut 1 和 Ki67（见补充表 S1了解更多详细信息）。所有抗体在多路复用之前都经过了广泛的验证（工作流程在补充数据的杰兹等。（2013）和贝伦斯等人。(2019)，首先在包含 15 种癌症类型（MTU481，Pantomics，CA）的多组织阵列中评估初级-次级克隆与同种型对照的染色敏感性和特异性。随后模拟多达 10 次的染料失活过程并评估染色性能，最后直接缀合每种抗体，这是多重染色过程和避免交叉反应问题所必需的。将所有生物标志物的染色模式与已知的阳性和阴性对照或细胞类型、来自人类蛋白质图谱的数据和/或研究团队先前的染色数据进行比较和验证。DAPI 在每个染色/成像轮次中刷新和成像，并用于图像配准。

　　2.3 归一化方法

　　我们汇总了表 1中总结的文献中的标准化方法和工作流程列表，并在补充材料和补充表 S3。中值归一化被定义为（等式 1）作为加法变换，将图像内所有对象的强度转移到全局中值，而不改变图像内对象强度分布的分布。例如，在图像 k ( ⁠一世克,j规范)等于图像 k ( ⁠一世克,j生的)因所有图像中所有对象的中值强度差异而移动 ( ⁠中位数⁡一世生的⁠ ) 减去图像 k ( ⁠中所有对象的中值强度中位数⁡一世克生的⁠）。

　　比较分割对象工作流中的规范化方法

　　我们首先通过比较每种归一化方法的性能来开始我们的评估，以纠正虚拟幻灯片图像中的系统误差（即批次效应）。我们将所有 297 430 个核对象用于分段对象标准化工作流程。除非另有说明，否则我们运行了 29 个测试场景（补充表 S6）针对每种标准化方法，其中校正了 2、3、10 或 14 个虚拟载玻片。图 2A展示了多种归一化方法的性能和比较（参见补充图S3和所有归一化比较结果的补充表 S7）。我们发现所有六种归一化方法都减少了评估对象的滑动到滑动误差（ANOVA P-值 < 1E-16），这是由 29 个测试场景中的 MEO-CV 量化的。除了 SQUA 方法（补充表 S7）。在对数空间中应用的 M 值 (TMM) 和中值比归一化 (MRN) 方法的修剪平均值表现最好，将幻灯片到幻灯片的误差降低了大约 10 倍，并且发现彼此之间没有统计学差异（使用 Bonferroni 校正P值 = 0.93 的Wilcoxon 秩和检验）。图 2B 和 C展示了一个测试场景示例，分别涉及在标准化之前和之后校正 14 个虚拟幻灯片。分段核对象预（图 2B）和后（图 2C）归一化的 DAPI 强度的完整分布呈现在补充图 S4。

图2

　　DAPI 分段核对象的规范化方法的性能。( A ) 条形图显示了 29 个测试场景中六种归一化相对于未校正情况的性能（最左侧的条形图）。条形图中位于 0.0738 的水平红色虚线是通过 TMM 方法在应用于对数空间（最右侧的条形）时实现的。每个条形的高度代表 29 个测试场景中 MEO-CV 的中值。在每个条中，有一条垂直线段表示 29 个测试值的范围。测试用例的平均值由靠近每个条形高度的较粗水平线段表示。两个插入线图 ( B, C ) 呈现 14 条线，每条线代表不同的虚拟载玻片。该ÿ轴是 85 个 TMA 样本位置中每个位置的评估对象的中位数。上面的线图 (B) 表示未校正的数据，下面的线图 (C) 表示在对数空间中使用 50% 分位数 (Q50) 方法进行归一化后的数据。水平虚线分别表示所有样本位置和虚拟载玻片前 (B) 和后 (C) 归一化的所有评估对象的全局中值强度

　　3.2 图像归一化前过滤对象的影响

　　接下来，我们评估了在将低图像质量细胞对象输入生物图像标准化方法之前过滤它们的方法。我们的假设是，通过在归一化之前对较低图像质量的对象进行预过滤，随后将改善幻灯片到幻灯片的误差校正。令人惊讶的是，我们了解到，在执行归一化时，使用所有 297 430 个核对象可以获得最佳的纠错性能（补充图S5）。我们用于过滤的图像质量指标是对象在所有 14 轮 DAPI 染色和成像中的像素相关性。如果像素的相关性较低，则在成像轮次中会出现模糊、组织移动甚至组织丢失。在纠正错误和偏移时，中等到低质量的对象仍然可以提供良好的信息。例如，非常轻微的组织运动或非常轻微的图像模糊会导致对象的像素相关性降低，从而降低其评估的成像质量。然而，作为对象边界内像素值的平均值计算的对象的平均强度值可以保持相对恒定。因此，它可能是一个模糊的物体，但从归一化生物图像的角度来看，它的强度值仍然是有用的。

　　3.3 评估基于网格的对象工作流程以标准化生物图像

　　我们评估了一种基于网格的对象归一化方法，以确定它是否可以达到与直接归一化分割对象（例如原子核）相同的性能水平。我们首先了解网格大小如何影响归一化性能。评估的网格尺寸范围从整个 FOV（2560 × 2160 像素2）到 16 的方形网格尺寸（15 × 15 像素2）。核分割对象的中值面积为 203 像素（补充表 S4 ) 大约等于网格大小为 16 (补充表 S5 )。我们发现 32 的网格大小产生了最佳性能，在 29 个测试场景中 MEO-CV 的中值为 0.0741（补充图S6A）。与使用整个图像相比，32 的网格大小有 9.2% 的改进（使用 Bonferroni 校正P值 = 4.7E-05 的Wilcoxon 秩和检验）。此外，与直接应用于原子核对象的 TMM 方法相比，使用 32 的网格大小在 MEO-CV 中仅略微减少了 0.4%（0.0741 对 0.0738， P值 = 0.092）。因此，无偏的基于网格的方法可以实现类似的性能（见补充图 S7比较分布）作为直接应用于分割核对象的 TMM 方法。

　　补充图 S6B使用范围从 50% 到 100%（Q50 到 Q100）的分位数呈现分位数归一化。75% 的分位数 (Q75) 取得了最佳性能。Q50 方法与 MRN 和 TMM 方法在应用于网格对象时性能损失了 42%。相比之下，当直接对分割的核对象进行归一化时，Q50、MRN 和 TMM 方法取得了最佳性能（图 2A，补充图S3）。

　　3.4 使用幻灯片控件标准化生物图像

　　接下来，我们想评估载玻片组织和细胞系对照样品的使用。为了评估它们在归一化中的用途，我们进行了一系列虚拟载玻片归一化模拟，这些模拟使用不同数量的对照样本来校正两个或三个虚拟 TMA 载玻片。总共有 27 个测试场景。对于其中的每一个，我们从每个虚拟 TMA 载玻片中随机选择对照样本。如图3A中所示，每个虚拟载玻片的随机选择的对照样品受到限制，使得用作一个虚拟TMA载玻片上的对照的随机选择的样品不能被选择并用作任何其他虚拟载玻片上的对照。

图3

　　控制样本数对TMA幻灯片图像纠错的影响。有限数量（1、2、3、4、10 或 20）的对照样品及其图像用于标准化虚拟 TMA 幻灯片图像。每次标准化进行 10 次，其中随机选择 TMA 样本并用作标准化的对照。每个虚拟载玻片的对照样品的随机选择受到限制，使得用作一个虚拟 TMA 载玻片上的对照的随机选择的样品不能被选择并用作任何其他虚拟载玻片上的对照。说明了一个示例 ( A )，其中从三个虚拟 TMA 载玻片中随机选择五个对照样本。条形图（B) 展示了将日志空间中的 Q75 归一化方法应用于每个虚拟幻灯片上的控制样本中大小为 32 的网格对象的性能。在对图像进行归一化后，对来自虚拟 TMA 载玻片的所有 85 个样本的核对象的评估用于计算 MEO CV。计算的性能基于涉及 2 或 3 个虚拟幻灯片的 27 个测试场景。“无”案例（最左边的条形图）是未校正的数据，中值为 0.728。该值与图 2中包含两个额外测试场景的未校正数据略有不同。水平红色虚线在条形图中位于 0.0738

　　图 3B显示了结果，并表明稳健的标准化需要十个或更多的幻灯片控件。依赖五个或更少的对照样本可能是有害的。换言之，仅依靠少数控制，数据中的误差在归一化后相对于原始未校正数据会增加的概率是不可接受的。即使有五个控件，控件在减少幻灯片之间的批次效应方面价值有限的概率仍然相对较高，如我们在模拟中观察到的范围所示（图 3B）。使用 10 到 20 个对照将范围缩小到更可接受的水平，但会带来减少 TMA 内实验样本可用位置数量的成本。我们的模拟表明，通过使用 5 个对照样本，在 270 (27 × 10) 次测试模拟运行中实现的 MEO-CV 的中位数为 0.134，这比使用 20 个对照样本时的误差高 36%。

　　3.5 基于网格的对象归一化性能演示

　　我们将网格对象标准化工作流程应用于在三张 TMA 载玻片上成像的 24 个多路复用生物标志物。作为示例，图 4显示了 85 个样本（包括 CRC 组织和细胞系）中 BCL2 相关 X、凋亡调节因子 (BAX) 蛋白染色的中值图像强度。对于四种细胞系中的每一种的未校正图像，载玻片 A3（图 4A）的 BAX 染色强度明显低于相应的载玻片 A1 和 A2。BAX 是 Bcl-2 蛋白家族的成员，是促凋亡的 ( Oltvai, 1993）。在比较不同的细胞系时，BAX 染色的减少可能表明对细胞凋亡的敏感性较低。然而，每张物理载玻片上的每个单独的细胞系样本都来自同一个石蜡包埋的细胞沉淀。此外，在生理培养条件下，四种细胞系中 BAX 蛋白水平的降低不太可能成比例地发生。与其他两张幻灯片相比，幻灯片 A3 的 BAX 强度降低纯粹是一种实验伪影（即幻灯片到幻灯片的批处理效果）。为了防止错误的生物学发现，在下游分析之前从数据中删除该伪影至关重要。我们应用了基于网格的对象归一化工作流程，网格大小为 32 像素，Q75 方法应用于日志空间。图 4A 中显示的归一化数据在三张载玻片上显示大致相等的 BAX 染色强度，并且四细胞系的相对比例现在在三张载玻片上是恒定的。图 4B显示了 HeLa 细胞系的三张载玻片上 BAX 染色的未校正和标准化图像。补充表 S10总结了基于网格的对象归一化工作流程的性能，该工作流程由四个细胞系评估，跨越 24 个独立的荧光标记的抗体标记，这些标记在相同的载玻片上进行分析。我们最终应用统一流形逼近和投影 (UMAP) 来可视化标准化前后的高维数据。UMAP 图 (补充图S8）清楚地显示了在归一化之前具有连续组织切片的三张载玻片之间的批次效应，然后在应用网格归一化方法后将其消除。这清楚地证明了基于网格的对象归一化工作流程能够减少实际数据中除 DAPI 之外的荧光标记抗体标记的批次效应。

　　图 4

　　将网格对象标准化应用于三个物理 TMA 载玻片的 BAX 染色，其中包括 85 个 CRC 组织和细胞系。（一）通过应用基于网格的对象工作流程（网格大小为 32 个像素）和对数空间中的 75% 分位数（Q75）方法，呈现未校正和归一化的三张幻灯片中每张图像的每个图像的中值 BAX 染色强度。三个 TMA 载玻片显示了四种细胞系 HeLa（方形）、HCT116（圆形）、MCF7（三角形）和 Jurkat（菱形）的强度。( B ) 三张载玻片上的 HeLa 细胞系图像显示在标准化前后