在培养细胞方案上对细胞内抗原进行免疫荧光染色

　　材料

　　磷酸盐缓冲盐水 (PBS) (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na 2 HPO 4 , 1.76mM KH 2 PO 4 , pH 7.4)

　　Tris 缓冲盐水 (TBS) (50mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.4)

　　固定试剂：PBS 中的 4% 甲醛或 100% 冰冷的 MeOH

　　透化试剂：1% Triton X-100 的 PBS (w:v)

　　封闭试剂：10% 正常血清（制备二抗的物种）、0.1% Triton X-100 的 PBS 或 TBS

　　一抗：纯化或生物素化形式

　　二抗：生物素化（用于 3 步方案）或荧光团偶联（用于 2 步方案）

　　可视化试剂：Invitrogen™ Streptavidin eFluor™ 605NC、Invitrogen™ Streptavidin eFluor™ 650NC 或 Streptavidin-FITC 封固剂：

　　封固剂：Fluoromount-G (SouthernBiotech) 或 Fluoro-Gel (EMS)

　　在孵化期间放置样品的加湿容器

　　实验程序

　　细胞以适当的密度铺板，并使其附着在载玻片或培养皿上（例如 8 腔载玻片中的 30,000 个细胞/腔）。细胞通常在染色前一天铺板，以达到 60-80% 的融合度。

　　在室温下用 4% 甲醛固定细胞 15 分钟或在 -20oC 下用 100% 甲醇固定 10 分钟。

　　注意：最佳固定（试剂和时间）取决于感兴趣的抗原，必须进行优化。时间和方法是建议的优化起点。

　　使用滴管将 PBS 加入腔室，然后抽吸去除缓冲液，在 PBS 中轻轻清洗细胞 3 次（5 分钟/洗涤）。

　　注意：从这一点开始至关重要的是，细胞不会变干，因为这会导致背景染色水平增加，并且难以解释染色结果。最好不要一次吸出超过 2 个孔，以减少孔内细胞干燥的可能性。

　　用透化试剂覆盖细胞。为限制蒸发，请使用一块封口膜紧紧地盖住腔室幻灯片的开口并放入加湿的容器中。在 37°C 下孵育 30 分钟，然后在室温下孵育 10 分钟。

　　注意：这些是建议的优化起始条件

　　如步骤 3 中所述，使用滴管和吸液在 PBS（5 分钟/洗涤）中轻轻清洗细胞 3X。

　　用封闭溶液覆盖细胞（100ul/8 室载玻片中的室）。在室温下在加湿的容器中孵育 1 小时。

　　如步骤 3 所述，取下封口膜盖并在 PBS 中轻轻洗涤细胞 3 次（5 分钟/洗涤）。

　　在封闭试剂中稀释一抗（按照制造商推荐的稀释度）并覆盖在细胞上。在室温下在加湿室中孵育 2 小时。

　　注意：低丰度抗原可能需要更长的一抗孵育时间，在 4°C 下长达 12 小时

　　如步骤 3 所述，在 TBS 中轻轻洗涤组织 3 次（5 分钟/洗涤）。如果使用未偶联的一抗，请继续执行步骤 10（3 步方案）。如果使用生物素化一抗，请继续执行第 12 步（两步方案）。

　　在封闭试剂中稀释生物素化或荧光团偶联二抗（按照制造商推荐的稀释度）并覆盖在细胞上。用封口膜盖住腔室载玻片，并在室温下在加湿室中孵育 1 小时。注意：如果使用荧光团偶联的二抗，请避光并避免 Triton X-100 与封闭剂接触。

　　注意：为获得最大信号强度，我们建议使用带有 Invitrogen™ eFluor™ 纳米晶体的 TBS

　　如上所述，在 PBS 或 TBS（5 分钟/洗涤）中轻轻洗涤细胞 3X。

　　将 Streptavidin eFluor 605NC、Streptavidin eFluor 650NC 或 Streptavidin-FITC 偶联物（按推荐稀释度）稀释在封闭试剂（TBS 中 10% 正常血清，省略 Triton X-100）中并覆盖细胞。用封口膜盖住腔室载玻片并在室温下孵育 30 分钟。我们建议从 1:100 稀释的 Streptavidin eFluor 605NC 开始。

　　如步骤 3 所述，在 TBS（5 分钟/洗涤）中轻轻洗涤细胞 3X。

　　使用推荐的安装介质之一安装和盖玻片。

　　如果需要，将载玻片保存在 4°C 避光。