免疫荧光 (IF) 使用抗体和荧光检测来研究目标蛋白在固定细胞或组织中的定位、相对表达和激活状态。IF 广泛用于不同的研究领域。

　　IF 可用于回答以下问题：

　　哪些细胞或组织表达我的目标蛋白？

　　我的靶蛋白的表达和/或激活如何响应实验扰动而变化？

　　靶蛋白定位在细胞/组织的哪个位置？

　　在细胞或组织结构的背景下，不同靶蛋白之间的空间关系是什么？

　　免疫荧光包括随着时间的推移而发展的许多相关技术。所有这些技术都利用抗体对生物靶标的特异性识别和细胞计数分析中荧光报告基因的检测。确保生物标本保存完好，而抗体可接触到靶抗原很重要，但可能会带来因样品、靶标和抗体而异的挑战。

　　在此页面上，我们汇编了资源，以帮助您浏览协议、回答常见问题并帮助您设计成功的 IF 实验。

　　选择正确的 IF 技术和协议

　　最佳 IF 技术/协议受生物材料类型、样品处理步骤、目标抗原特性和所使用的特定抗体的影响。

　　考虑因素包括：

　　输入材料可以是培养的细胞系、冷冻组织或福尔马林固定的石蜡包埋 (FFPE) 组织。

　　对于培养的细胞系和原代细胞，寻找经过免疫荧光-免疫细胞化学 (IF-IC) 验证的抗体。

　　在许多实验室中，“免疫组织化学/IHC”被用作一个包罗万象的术语，包括石蜡包埋或冷冻的组织，可用于包括显色和荧光检测。在 cellsignal.com 上，应用程序区分冷冻 (IF-F) 和石蜡包埋的组织制剂。

　　对于 FFPE 组织样本，如果靶抗原丰富，经免疫组织化学 (IHC-P) 验证的抗体也可用于荧光检测而无需扩增，或用于具有信号放大的多重 IHC ( mIHC )。

　　抗体可针对上述一种或多种应用进行验证。协议建议是科学家在验证过程中测试的结果。

　　可以在每个产品网页上找到特定于产品的协议。对于 IF 验证的抗体，在产品页面上选择“IF”以查看 IF 验证数据和协议。每种抗体的基本信息（稀释/工作浓度、验证应用、物种反应性、宿主物种）都包含在产品数据表中。

　　最常用的 IF 协议也可以在协议页面上找到。

　　不需要或想要对您的组织样本使用荧光检测？另一种方法是显色检测，见IHC 页面。

　　为 IF 选择抗体：抗体验证的重要性

　　最好的抗体会产生强烈的特异性信号，且背景最低。选择已在您将使用的应用程序中验证的抗体非常重要。IF 中的抗体验证可以包括阳性和阴性表达实验（使用敲除细胞系、遗传模型、CRISPR 或 RNAi）、靶蛋白定位或翻译后修饰的实验操作以及方案优化。

　　抗体的性能因应用而异。例如，在蛋白质印迹实验中表现良好的抗体可能在 IF 中表现良好，也可能不表现。在测试新抗体期间，一些抗体会表现出轻微的脱靶结合；绝不建议将这些用于 IF 或其他非 WB 应用。此外，抗体可能在冷冻组织上表现良好，但在 FFPE 组织上表现不佳，反之亦然。抗体灵敏度和性能可能会根据样品的固定和处理方式以及抗体工作条件而改变。

　　一旦您决定在您的实验中使用哪种类型的生物样品以及它们将如何制备，在 cellsignal.com 上浏览抗体的最简单方法是首先选择合适的应用程序。然后，您可以输入搜索词或选择其他属性（例如宿主物种、研究领域等）以进一步优化您的搜索并选择已在您需要的应用程序中验证的抗体。

　　为 IF 设计控制实验

　　为了对您的实验设计和结果充满信心，并且您的抗体忠实地报告了它的目标，阳性和阴性对照实验可以提供丰富的信息。例如：

　　仅二抗对照可以告诉您二抗是否存在非特异性结合。

　　通过设计敲除/siRNA 实验或通过比较已知的表达和非表达细胞系来确认一抗的特异性。

　　单目标实验用于建立光谱分离成像。这种类型的实验可能有助于确定缺乏染色是否是由于当 2 个抗原彼此非常接近时发生的空间位阻。

　　用磷酸酶处理样品以确认磷酸特异性抗体仅识别 IF 中的磷酸化靶标。

　　如果您怀疑固定或透化存在问题，检查过去在您的实验室中有效的抗体可能有助于排除故障。

　　作为我们验证过程的一部分，Cell Signaling Technology (CST) 科学家经常执行这些类型的控制（参见示例）。在您的实验模型系统中设置类似的控制是值得的，特别是如果您难以获得所需的结果。

　　一抗与二抗以及直接与间接染色

　　一抗提供对目标抗原的特异性识别。二抗与一抗的结合基于它们在其中饲养的物种。在兔或小鼠中培养的一抗可以分别用抗兔或抗小鼠二抗进行检测。

　　与荧光团偶联的一抗和二抗（对一抗的宿主物种特异性）的配对称为间接染色。使用与荧光团偶联的一抗，无需二抗，称为直接染色。直接染色方法可以节省时间并允许使用在同一宿主物种中产生的抗体进行多重检测。由于多个二抗与单个一抗结合时发生的信号放大，间接染色传统上可提供更高的灵敏度。

　　还可以使用这些技术的其他变体，例如使用带有亲和素/链霉亲和素偶联荧光染料的生物素化一抗。荧光团偶联的F(ab') 2 二抗片段（缺少 Fc 结构域）有助于降低背景。在mIHC 中，辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联的二抗用于催化酪胺-荧光团偶联物的沉积。

　　可以复用多少个靶标/抗体？

　　多路复用通过多种抗体一次检测多个目标，并检测每个目标的不同波长（颜色）。对于间接染色，多路复用的能力依赖于荧光团偶联的物种特异性二抗与每个一抗的配对。来自不同同种型的小鼠抗体也可以使用同种型特异性二抗进行多路复用，允许一次检测多达 5 种小鼠抗体。对于直接染色，每个一抗应与不同的荧光团偶联。这允许组合来自同一物种/同种型的多个抗体，并且还允许“小鼠对小鼠”染色，因为抗小鼠二抗与小鼠组织的非特异性结合不是问题。

　　在设计多重 IF 实验时，应考虑荧光显微镜的光谱特性，包括可用的激发源和过滤装置，以避免光谱渗漏。现代落射荧光和共聚焦荧光显微镜通常具有区分 3 个或更多通道的能力。

　　将抗体染色与染料或标签相结合

　　用于固定后或可固定活细胞标记的细胞染料可纳入 IF 工作流程。细胞器标记通常用于验证目标的亚细胞定位。表达的标签，如 GFP，通常用于跟踪转染的细胞或用于镶嵌实验；如果 GFP 荧光信号低，可以在 IF 中使用抗 GFP 抗体。使用染料或荧光蛋白会占据荧光通道，使抗体可用的更少。

　　为您的实验选择荧光团

　　这将取决于您可用的激发源和激发/发射过滤的光谱特性。在运行实验之前评估荧光团的激发和发射曲线，以避免荧光渗出。CST 提供多种荧光团偶联一抗和二抗，包括 Alexa Fluor ®系列中的染料。

　　样品制备

　　组织

　　可以通过在最佳切割温度 (OCT) 介质中快速冷冻或通过固定和包埋在石蜡中来制备组织切片。冷冻样品可以使用低温恒温器切片，并在下一步固定前 10 至 15 分钟在载玻片上风干。对于 FFPE 组织样本，对采集、固定和石蜡包埋步骤的要求可能因单个组织类型而异。

　　冷冻与 FFPE 组织

　　一般来说，FFPE 组织比 OCT 包埋的冷冻组织具有更好的形态。这可能更容易量化阳性细胞或识别染色之间的边界。FFPE组织也很稳定；一旦嵌入，组织块可以储存多年。这种类型的组织也更容易在实验室之间运输，是人体病理标本的首选处理方法。

　　另一方面，FFPE 组织经历了几个额外的处理步骤，这些步骤会减少由于蛋白质降解而导致的抗原总量，需要揭露步骤来检测剩余的抗原，并加剧醛诱导的自发荧光。除非使用非常丰富的蛋白质，否则剩余的抗原可能难以通过间接 IF 检测，并且可能需要放大以产生合适的染色。抗原修复也有可能揭示通常不会被检测到的抗原，否则会产生预期染色模式的抗体可能会产生非特异性染色。同样可以使用需要特定抗原修复方法来检测目标表位的目标。因此，重要的是要考虑如何验证抗体以及使用它需要哪些步骤。

　　在 OCT 嵌入冷冻组织的情况下，减少处理优先于形态。这是获得免疫染色结果的最快方法，因为切片在组织被切割的那一刻就可以使用，并且嵌入前的处理步骤更少。蛋白质降解更少，更多抗原可用于结合抗体，无需任何额外的、苛刻的修复步骤。因为这种方法不需要扩增，所以对组织质量比较敏感。固定类型（酒精与醛）、持续时间（某些目标如转录因子需要更短的固定时间）和组织年龄（尤其是切片后）都很重要，并且会因目标而异。最后，使用冷冻组织为目标选择提供了更大的灵活性，

　　培养细胞

　　细胞必须接种在与荧光显微镜兼容的支持材料上。典型的支持物包括玻璃底细胞培养皿、用聚赖氨酸和/或细胞外基质成分制备以支持贴壁细胞培养的玻璃盖玻片（保存在塑料培养皿中），以及安装在与显微镜兼容的载玻片上的市售多孔室。

　　请注意，细胞培养条件可能会影响目标蛋白的细胞健康、形态和表达/定位，并最终决定 IF 数据的质量。通过定期检查培养基的 pH 变化并在显微镜下以低倍率检查细胞应激迹象（例如多核细胞），确保您的细胞健康。还要检查细胞的汇合是否适合细胞类型和目标。

　　样品固定

　　理想的固定剂保留“栩栩如生”的快照，同时通过交联和抑制内源酶快速停止自溶的降解过程，并呈递抗原以供抗体识别。不幸的是，没有一种固定方法可以对每个样品和每种抗原都表现出理想的效果。即使是同一靶蛋白上的不同抗原也可能在方案之间表现出差异。这就是为什么最佳方案不仅会因样本类型而异，而且会因表位（和抗体）而异。

　　组织

　　对于新鲜冷冻的组织，已经冷冻和低温切片的切片现在应该用固定剂处理。或者，组织样品可以通过先用经心灌注或浸入固定、固定后和冷冻保存步骤进行保存，然后冷冻和切片。

　　在FFPE 组织处理中，组织通过用福尔马林（或其他醛基固定剂）浸泡固定或如上所述灌注，然后石蜡包埋和切片进行保存。在与抗体孵育之前，切片必须经过脱蜡、再水化和抗原修复步骤，以使抗体能够进入样品并结合目标分子。

　　细胞

　　在固定前立即用温热的无蛋白质培养基或 PBS 冲洗细胞可以防止细胞外蛋白质和碎片沉淀。快速固定是通过快速更换固定液来完成的。

　　醛固定与酒精固定

　　当保护结构至关重要时，最常使用基于醛的固定剂，例如甲醛、福尔马林（溶解的甲醛与较低百分比的甲醇的混合物）和戊二醛。对于大多数抗体，CST 建议使用 4% 甲醛（无甲醇）进行固定。醛与细胞蛋白的伯胺发生反应并交联并稳定样品。此外，细胞酶，包括磷酸酶和蛋白酶，通过交联而失活。醛比醇更好地穿过质膜并固定可溶性蛋白质，但一些靶标可能会因醛交联而失去其抗原性。

　　脱水/变性酒精固定剂，如甲醇，会置换细胞大分子周围的水，导致它们原位变性和沉淀。目标蛋白的变性可能会暴露隐藏的表位，这使得这种方法对某些抗体而言优于醛固定。然而，脱水固定剂不太适合可溶性靶标和修饰状态特异性抗体，例如磷酸化抗体。查看产品数据表以了解最佳固定方法。

　　选择渗透剂

　　如果使用交联固定剂，质膜仍然是完整的，使抗体无法进入细胞内靶点。因此，除非您的抗体识别细胞外表位，否则应在交联固定后进行透化。最佳透化方法因抗体而异；始终检查产品页面以获取推荐的协议。

　　固定后使用 Triton ® X-100 通透是很常见的。Triton 和其他去污剂，如 NP-40、TWEEN ®、皂甙、洋地黄皂苷和 DOTMAC，与细胞膜相互作用以产生可变的“孔”大小并允许抗体进入。

　　或者，可以在固定步骤之后用乙醇或甲醇进行醇渗透。该方法将交联固定剂的快速固定与膜的中间蛋白质变性和脱脂相结合。这可以改善某些目标的信号，特别是那些与细胞器或细胞骨架相关的目标。

　　多路复用时我使用什么修复/烫发条件？

　　如果您使用需要不同 CST 协议的抗体进行多重检测，您可能需要优先考虑在最佳条件下使用哪种抗体。本应用说明 (PDF) 中显示了在 mIHC 中执行的顺序优化示例。在扩大实验规模之前，进行比较不同协议的小规模测试运行可能会提供信息。

　　选择封闭试剂

　　最常见的建议是在 PBS + 0.3% Triton ® X-100 中加入5% 正常山羊血清（或与二抗来自同一物种的血清）。查看数据表以获取推荐的封闭剂。

　　如果样品中存在 Fc 受体，抗体信号将来自特异性靶标识别（通过抗体的抗原结合位点/可变区）以及抗体重链与 Fc 受体结合的非特异性吸收的混合。动物血清中存在的总 IgG 会阻断 Fc 受体，以防止一抗和二抗结合并降低背景噪音。选择荧光团偶联的 F(ab') 2片段也将避免 Fc 受体与二抗（但不是一抗）结合

　　在其他基于抗体的应用中，例如蛋白质印迹，封闭步骤可减少由一抗和二抗与其预期靶标以外的位点的非特异性、低亲和力结合引起的背景信号。然而，我们发现在 IF 中经过严格测试的重组兔单克隆抗体在有或没有封闭的许多样品上表现良好。最终，选择经过免疫荧光验证的优质抗体在避免背景噪音方面大有帮助。

　　IF 中的抗体浓度和信噪比

　　信噪比 (S/N) 与抗体在特定应用中的特异性和灵敏度有关。可以通过将表达感兴趣目标的细胞中荧光强度的“信号”与缺乏表达的细胞的“背景噪声”进行比较来计算 S/N。如果抗体浓度太低，荧光信号会太暗而无法与背景噪声区分开来。另一方面，过高的浓度会导致背景染色，降低 S/N。始终查看产品数据表中推荐的稀释度，该稀释度基于抗体验证期间执行的滴定。

　　抗体孵育时间

　　通常，在 4°C 下过夜孵育会产生强信号。改变孵育时间和温度会改变信号和 S/N。不同的抗体可能对变化的孵育条件有不同的反应；有关更多信息，请参阅此博客文章。

　　我需要使用共聚焦显微镜来执行 IF 吗？

　　IF 可以在任何具有适当激发源和过滤的荧光显微镜上进行，包括落射荧光、扫描和旋转圆盘共聚焦显微镜。免疫荧光通常也与专门的荧光技术兼容，包括全内反射荧光 (TIRF)、光片显微镜和一些超分辨率技术。

　　与自动化高通量筛选/高内涵分析的兼容性

　　任何获准用于 IF-IC 的抗体均可用于高通量筛选 (HCS) 和高内涵分析 (HCA)。这些实验基于标准 IF 技术，并结合了自动化。