每个免疫荧光染色方案由四个主要步骤（培养、固定、染色、成像）组成

　　免疫荧光染色是一种非常敏感的方法，可能需要排除故障。协议中的微小变化可能导致不再具有可比性的不同结果。因此，在您的特定方案中精确保持完全相同的条件（例如，细胞密度、抗体稀释度、孵育温度和孵育时间）非常重要。以下是间接免疫荧光染色方案的不同步骤的概述。

　　实验计划和样品制备

　　在开始免疫染色之前，应进行文献研究以确定所选模型系统中感兴趣的蛋白质的表达水平和细胞内定位。一些蛋白质通常或在某些细胞系中的表达非常低。在这种情况下，表达可能必须由外部刺激或过表达技术诱导。

　　此外，必须确定最佳细胞密度。一般来说，建议免疫细胞化学的汇合度为 70%–80%。

　　此外，必须确定理想的细胞培养容器几何形状和底物/涂层，并且需要与所选的显微镜方法兼容。在整个实验过程中，细胞永远不会变干至关重要，在选择合适的细胞培养容器几何形状时应考虑这一点。

　　最后，应提前计划要染色和分析统计显着性的样本数量，包括适当的控制。对于复杂的方法，建议创建实验条件示意图，包括计划的染色（包括阳性和阴性对照）。

　　样品固定

　　免疫荧光染色方案的第一步是固定样本。这通常通过在室温下将样品在 4% 福尔马林溶液（在 PBS 中，pH 7.4）中孵育 10 分钟来完成，这会使蛋白质交联。样品也可以固定在 100% 冷冻甲醇或丙酮中。

　　应为每个实验单独确定最佳固定条件。有些蛋白质会被甲醇固定破坏，有些抗体不能检测福尔马林固定样品中的蛋白质。固定后，将样品在洗涤液（例如 PBS）中洗涤 3 次 5 分钟以完全去除固定液非常重要。

　　细胞透化

　　为了染色细胞内蛋白质，细胞需要被透化。如果没有这一步，抗体就不可能通过脂质膜进入细胞。透化需要在去污剂中孵育，例如在 PBS 溶液中的 Triton X-100 或 Tween-20（用于较不苛刻的透化）。

　　此步骤必须根据感兴趣的蛋白质、使用的抗体和实验条件进行优化。特别是在对膜蛋白进行染色时，透化步骤必须小心，因为 Triton X-100 会破坏细胞膜。在这种情况下，使用皂苷可能是经典洗涤剂的替代品。不要忘记甲醇固定的样品已经透化，因为酒精很容易洗掉细胞膜的脂质。

　　在这一步之后，样品必须在洗涤溶液中洗涤 3 次，每次 5 分钟。

　　阻塞

　　为了尽量减少细胞内或细胞外背景信号，应通过在 (1) 制备二抗的宿主血清、(2) 牛血清白蛋白 (BSA)、或 (3) 牛奶。第一个选项是最推荐的，因为它的特异性最高。

　　典型的阻塞时间为 30 分钟至 1 小时。应避免过长的封闭步骤，因为这会降低一抗的特异性结合，从而降低信号。

　　一抗孵育

　　一抗的选择及其孵育条件是免疫荧光染色方案中最关键的一步。特别是，如果该协议尚未在实验室中建立，则文献研究至关重要。合适的一抗必须对目标抗原具有高特异性。此外，抗体是单克隆抗体还是多克隆抗体会影响其特异性。许多抗体制造商在其产品页面上列出了参考文献，其中抗体已成功用于免疫荧光染色。

　　一抗的另一个高度相关的特性是它的来源宿主，因为它决定了二抗。这在进行多色染色时尤其重要，因为用于平行检测同一样品中的几种抗原的不同特异性一抗必须在不同的宿主中产生，以避免交叉反应。

　　必须为每个实验仔细确定最佳孵育条件。抗体浓度过高和孵育时间过长会导致非特异性背景信号。相反，浓度过低和孵育时间过短会导致信号非常微弱或丢失。

　　与一抗孵育后，样品应在洗涤溶液中洗涤 3 次，每次 5 分钟，以避免背景荧光。

　　二抗孵育

　　在标准的免疫荧光检测中，二抗与荧光团结合，荧光团在特定波长下被激发时会发光。二抗与一抗特异性结合。因此，二抗必须对产生一抗的宿主具有特异性。对于成功的实验，所选的显微技术和设备（过滤器、激光器、相机和检测器）还需要与所选的荧光染料兼容。

　　为了适用于荧光显微镜，必须使用稳定的荧光团，因为样品通常暴露于大量光子。此外，应考虑荧光团的亮度，因为表达水平最高的抗原应该用亮度最低的荧光团检测。在进行多色染色时，还应仔细考虑共轭荧光团的光谱重叠。可以在制造商的网站上找到相应的表格。

　　二次抗体溶液中的孵育应根据制造商的协议进行。由于荧光团对光敏感，从现在开始，协议的所有步骤都需要在黑暗中进行。

　　为了避免背景荧光，在与二抗孵育后，样品应在洗涤液中洗涤 3 次，每次 5 分钟。

　　复染和安装

　　显微镜前的最后一步是对细胞核进行复染和安装。为了避免样品变干，并保证细胞环境的稳定折射率（成功显微镜检查的先决条件），需要安装样品。

　　为此，样品应覆盖具有低自发荧光的封固剂。DAPI 是核复染的标准，可以包含在封固剂中，也可以单独添加。

　　显微镜

　　为了获得最佳结果，免疫荧光染色的显微镜分析应在安装后直接进行。

　　存在许多显微镜技术，每种技术都针对不同的实验方法进行了优化。对于标准免疫荧光染色，落射荧光和共聚焦显微镜是广泛使用的方法。当然，放大和曝光等所有参数都应仔细和单独确定。