免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是基于抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色来对组织内抗原进行定位、定性、定量的一项技术。

　　根据抗原抗体反应和化学显色原理。从待测组织或细胞中提取蛋白作为抗原，先与一抗结合形成抗原抗体反应物，再与生物素或荧光素标记的二抗反应，通过化学显色可以在显微镜下清晰观察到抗原抗体反应物，从而能在组织切片上确定抗原的分布和含量。

　　免疫组化材料的准备

　　切片的选择

　　石蜡切片：通过石蜡包埋固定好的组织标本，并用切片机切片的方法。是制作组织标本最常用、最基本的方法。能保存好组织形态且可以做连续切片，有利于各种染色对照观察，并且可以长期存档做回顾性研究。但高温烤片可能会破坏组织的抗原性。

　　冰冻切片：在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。能较好保存组织的免疫活性，在免疫组化时不需要抗原修复。但细胞内易形成冰晶破坏细胞结构，可能会使抗原弥散，切片较厚不美观。

　　抗体的选择

　　单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色。

　　种属来源：根据一抗的来源决定二抗的选择。若一抗是小鼠来源，那么二抗选择抗小鼠的即可（例如羊、兔）。

　　根据实验目的是检测什么种属的抗原选择抗体，避免出现交叉反应。

　　购买之前咨询该抗体是否可以做免疫组化。

　　一般可以做石蜡切片的抗体都可以用来做检测冰冻切片，但可以做冰冻切片的抗体不一定能检测石蜡切片。

　　免疫组化实验流程

　　实验步骤主要包括样品制备以及样品染色（以石蜡组织切片为例）

　　样品制备

　　组织固定：根据要求收集人或动物的组织用于IHC分析，冲洗并用固定剂（一般用甲醛）进行固定

　　组织包埋：将经甲醛固定的组织嵌入石蜡，以长期保持其天然形状和组织结构

　　切片安装：将组织样品在切片机上切片，并转移至载玻片上干燥保持其形态

　　脱蜡水化：因切片上的石蜡会妨碍染色，所以需将切片上的石蜡溶出，并水化。脱蜡或水化不全容易造成非特异性背景着色（一般的脱蜡水化步骤是：将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-无水乙醇5min-95%无水乙醇5min-90%无水乙醇5min-80%无水乙醇5min-70%无水乙醇5min-50%无水乙醇5min-蒸馏水5min×3，进行脱蜡水化）。

　　抗原修复：由于组织在甲醛固定过程中，蛋白之间发生了交联及醛基的封闭从而掩盖抗原决定簇。可以通过高压加热修复抗原，使细胞内抗原决定族暴露，从而提高抗原检测率

　　非特定位点封闭：为了防止一抗的非特异性结合造成假阳性，可以选用BSA、羊血清等封闭非特异性结合位点。封闭血清来源一般与二抗保持一致，室温封闭10-30min

　　样品染色

　　一抗、二抗孵育：抗体孵育时间、温度及浓度等因素对染色结果都存在很大影响。在4℃下反应缓慢，背景较浅；37℃反应较快时间较短；而室温介于两者之间，选择室温有利于实验的进行。二抗一般室温孵育30min

　　底物显色：基于与酶缀合的二抗，抗原通过生色或荧光方式直接检测

　　复染封片：组化染色后进行复染可以衬托出组织形态结构，常用的复染剂有苏木精、曙红、甲基绿、DAPI和Hoechst荧光染色。观察结束后使用中性树胶进行封片，可以长久保存