在实验室中，研究人员投入时间和精力来优化 IHC 的样品制备和样品染色过程。成功后，结果会产生强烈而具体的信号。但是，我们如何知道结果已被正确解释？在设计 IHC 实验时，包含阳性和阴性对照至关重要。对照将有助于验证观察到的 IHC 染色结果在暴露实验伪影时是否准确有效。

　　目前，有 6 种已建立的 IHC 对照可帮助您确定观察到的抗体染色的特异性。

　　故障排除指南

　　1. 阳性组织对照

　　对于阳性组织对照，已知表达您感兴趣的蛋白质的组织类型会被染色。如果结果是阳性的，则该测定正常工作。如果阳性对照没有发生染色，是时候对染色方案进行故障排除了！

　　要确定合适的阳性对照，一个很好的起点是检查抗体的数据表。Boster Bio 在数据表上提供了 Uniprot ID，以便您能够访问表达您对蛋白质感兴趣的组织的列表，这些组织可用作阳性对照。

　　2. 阴性组织对照

　　阴性组织对照用于揭示非特异性结合和假阳性结果。选择已知不表达感兴趣的蛋白质的组织。阴性对照不应表达靶抗原。如果发生染色，您可以确认染色是非特异性的。常见的阴性对照组织是敲除 (KD) 或敲除 (KO) 组织样本。

　　3. 内源性组织背景控制

　　某些细胞和组织类型，特别是那些富含胶原蛋白、弹性蛋白和脂褐质的细胞和组织，具有发出自然荧光（又称自发荧光）的固有生物学特性。如果没有注意到这一点，当它实际上是背景染色时，可能会被误解为阳性染色。为防止这种情况发生，请使用荧光显微镜检查组织的一部分以获取荧光标记或使用明场显微镜检查显色标记，以确认组织不会显示内源性背景。

　　4.没有主要控制

　　顾名思义，没有一级对照（也就是只有二级抗体的对照），遵循相同的协议，除了组织没有与一级抗体一起孵育。样品仅与抗体稀释剂一起孵育，不添加一抗。之后，将样品与二抗和其他检测试剂一起孵育。这是为了确定二抗是否与细胞成分非特异性结合，从而导致假阳性或非特异性结合。

　　5. 同型对照

　　使用单克隆抗体时，请考虑在您的实验中加入同种型对照。同种型对照是与一抗具有相同同种型（例如 IgG2、IgM、IgY）、克隆性、偶联物和宿主物种的抗体，其靶向样品中不存在的分子。例如，目标可以是化学或非哺乳动物蛋白质。

　　不是用特异性一抗孵育样品，而是在相同实验条件下将同种型对照样品与相同浓度的同种型对照抗体一起孵育。这种控制的结果将有助于验证观察到的染色确实是特异性的，而不是由抗体与样品的非特异性相互作用产生的。

　　6. 吸收控制

　　吸收对照用于测试一抗是否与感兴趣的抗原特异性结合。抗体首先与免疫原一起孵育过夜。饱和后，灭活抗体取代 IHC 方案中用于对照的一抗。与观察到的染色相比，这将导致特定抗体结合位点的组织染色很少或没有染色。

　　重要的是要记住，如果免疫原是纯化的肽，则吸收控制效果会更好。如果免疫原是一个完整的蛋白质，蛋白质和组织之间可能会发生非特异性结合，从而导致错误的解释。

　　既然您已经阅读了大约 6 种类型的 IHC 对照，请务必在您的 IHC 实验中包含阳性和阴性对照以验证您的结果！