细胞应直接在多孔板、腔室载玻片或盖玻片上生长、处理、固定和染色。

免疫荧光实验方案（细胞免疫荧光步骤）

　　免疫荧光实验所需材料

　　PBS

　　多聚甲醛

　　甲醇

　　蒸馏水 (dh 2 O)

　　PBST：1X PBS，0.1% Triton X-100。要制备 1L，将 100ml 10X PBS 添加到 900ml dH2O 中。加入 1ml Triton X-100 并混合。

　　一抗

　　荧光染料偶联二抗

　　安装介质

　　标本制备

　　为了增加细胞粘附，在室温下用 1:10 稀释的聚赖氨酸溶液处理盖玻片 5 分钟。

　　以适当的稀释度培养细胞并生长直到细胞达到所需的汇合度 (~70%)

　　吸出介质

　　在 PBS 中短暂冲洗细胞。

　　固定步骤

　　吸出 PBS，在 PBS 中用 2-4% 的甲醛覆盖细胞（在通风橱中工作）。让细胞在 RT 固定 15 分钟。

　　吸出固定剂，在 PBS 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

　　透化（可选）

　　甲醇和丙酮固定导致透化细胞制剂。对于多聚甲醛固定的制剂，用 0.2% Triton X-100 处理 5 分钟，或者用 -20°C 甲醇处理 5 分钟。

　　甲醇透化步骤：甲醛固定后，用冰冷的100%甲醇覆盖细胞（用量足以将细胞完全覆盖至3-5mm深度，不要让细胞干燥），将细胞在甲醇中冷冻10分钟。

　　在 PBS 中冲洗 5 分钟。

　　阻塞步骤

　　注意：所有孵育均应在 RT 下进行，除非另有说明，应在潮湿的不透光盒子或有盖的盘子中进行，以防止干燥并防止荧光染料暴露在光线下。

　　在 PBS、1% Triton X-100 中加入 5% 正常血清作为二抗（例如正常山羊血清、正常驴血清），将样品封闭 1 小时。（推荐的封闭缓冲液在含或不含 0.2% Tween 20 和 0.02% 叠氮化钠的 TBS (PBS) 中的 1-2% 牛血清白蛋白、胎牛血清白蛋白或 2% 脱脂奶粉之间变化。）

　　一抗孵育

　　在 PBS、0.1% Triton 中稀释一抗。典型体积为：每部分 50-100ul，每个盖玻片、腔室或孔（48 或 96 孔板）25-50ul。

　　吸出封闭液，应用稀释的一抗。

　　在 4°C 下轻轻摇动或摇动孵育过夜。

　　在 PBS、0.1% Triton X-100 中冲洗 3 次，每次 5 分钟。

　　二抗孵育

　　与在 PBS、0.1% Triton X-100 中稀释的荧光染料偶联二抗在室温下避光孵育 1-2 小时。（从此时起，幻灯片需要保存在黑暗中。）

　　在 PBS、0.1% Triton X-100 中冲洗。

　　荧光检测

　　安装盖玻片。

　　立即使用荧光显微镜检查或平放在 4°C 的黑暗中。