免疫荧光是一种技术，通过结合与荧光染料（如异硫氰酸荧光素 (FITC)）化学偶联的特定抗体，可以显示细胞或组织切片中的特定蛋白质或抗原。免疫荧光染色方法主要有两种：1）直接免疫荧光染色，一抗用荧光染料标记；2）间接免疫荧光染色，用荧光染料标记的二抗识别一抗。可以对固定在载玻片和组织切片上的细胞进行免疫荧光染色。在荧光显微镜或共聚焦显微镜下检查免疫荧光染色的样品。

　　由于荧光素和罗丹明等荧光染料可以与抗体偶联而不会破坏其特异性，因此偶联物可以与抗原复合并通过荧光显微镜观察。显微镜通过一种或多种波长的光激发选定的染料，进而发射由选择性滤光片捕获的特征波长的光。然后用局部荧光区域投影图像，指示由不同颜色的抗体标记的不同抗原。

　　直接免疫荧光

　　抗体本身与荧光染料结合并直接应用于单层细胞或载玻片上的冷冻组织。当用荧光显微镜检查时，用荧光化合物标记的抗体可识别局部抗原。

　　间接免疫荧光

　　与直接免疫荧光不同，间接免疫荧光是一种双层技术。未标记的抗体直接应用于组织基质，然后用荧光染料偶联的抗 IgG 处理。这种技术有几个优点，通常比直接方法更频繁地使用。由于几种荧光抗免疫球蛋白可以与第一层中存在的每种抗体结合，因此产生比直接方法更亮的荧光。它也更省时，因为只有一种荧光标记试剂，即在漫长的偶联过程中制备的抗 IgG。此处介绍了仅用于间接免疫荧光技术的一般协议。

　　所需材料

　　组织载玻片

　　盖玻片

　　滑动架和托盘

　　用盖子染色盘子

　　轨道振动器

　　PAP 笔和移液器

　　去离子水 (ddH 2 O)

　　PBS（磷酸盐缓冲液）

　　一抗

　　荧光标记二抗

　　正常血清

　　甘油

　　免疫荧光协议 - 组织

　　样品制备

　　将样品灌注或解剖并固定在 4% 多聚甲醛固定剂中。

　　将组织转移到含 20% 蔗糖的 PBS 中，在 4°C 下放置过夜。

　　将组织转移到 PBS 中的 30% 蔗糖中，放置在 4°C 以完全浸渍。当组织下沉时，它被完全浸渍。

　　冷冻并切割 5-20mm 厚的低温恒温器切片

　　阻塞步骤

　　在 PBS 中的 5% 正常血清（二抗宿主血清）中孵育载玻片 1 小时。

　　用 PBS 清洗 3x 5 分钟。

　　一抗孵育

　　与荧光标记的二抗在 PBS、0.1% 正常血清中在黑暗中室温孵育 1-2 小时。（从此时起，将幻灯片放在黑暗中。）

　　用 PBS 清洗 3 倍。为了降低背景，可以在 PBS 中加入 0.1% Tween 20。

　　荧光检测

　　安装盖玻片。

　　立即使用荧光显微镜检查或平放在 4°C 的黑暗中。