免疫染色是生物化学中的一个通用术语，适用于任何使用基于抗体的方法来检测样品中的特定蛋白质。免疫染色一词最初用于指组织切片的免疫组织化学染色，正如 Albert Coons 在 1941 年首次描述的那样。然而，现在，免疫染色涵盖了组织学、细胞生物学和分子生物学中使用的广泛的技术，这些技术利用了基于抗体的染色方法。

　　免疫染色技术

　　免疫组织化学

　　组织切片的免疫组织化学或 IHC 染色（或免疫细胞化学，即细胞染色）可能是最常用的免疫染色技术。虽然 IHC 染色的第一个案例使用荧光染料（参见免疫荧光），但现在使用其他使用过氧化物酶（参见免疫过氧化物酶染色）和碱性磷酸酶等酶的非荧光方法。这些酶能够催化反应，产生易于通过光学显微镜检测到的有色产物。或者，可以使用放射性元素作为标记，并且可以通过放射自显影来观察免疫反应。

　　组织制备或固定对于保存细胞形态和组织结构至关重要。不适当或长时间的固定可能会显着降低抗体结合能力。许多抗原可以在福尔马林固定石蜡包埋的组织切片中成功展示。然而，即使是适量的醛固定，一些抗原也无法存活。在这些条件下，组织应在液氮中快速新鲜冷冻并用低温恒温器切割。冷冻切片的缺点包括形态差、在较高放大倍率下分辨率差、难以切割石蜡切片以及需要冷冻保存。或者，振动切片不需要通过有机溶剂或高温处理组织，这会破坏抗原性，或因冻融而中断。振动切片的缺点是切片过程缓慢且困难，组织柔软且固定不良，并且切片中经常出现颤动痕迹或振动线。

　　许多抗原的检测可以通过抗原修复方法得到显着改善，该方法通过破坏固定形成的一些蛋白质交联来发现隐藏的抗原位点。这可以通过加热不同时间长度（热诱导表位修复或 HIER）或使用酶消化（蛋白水解诱导表位修复或 PIER）来实现。

　　IHC 染色的主要困难之一是克服特定或非特定背景。优化固定方法和时间、使用封闭剂进行预处理、用高盐孵育抗体以及优化抗体后洗涤缓冲液和洗涤时间对于获得高质量的免疫染色都很重要。此外，染色阳性和阴性对照的存在对于确定特异性至关重要。

　　流式细胞仪

　　流式细胞仪可用于直接分析表达一种或多种特定蛋白质的细胞。使用类似于用于免疫荧光的方法在溶液中对细胞进行免疫染色，然后通过流式细胞术进行分析。

　　与 IHC 相比，流式细胞术有几个优点，包括：能够通过大小和粒度定义不同的细胞群；排除死细胞的能力；提高灵敏度；和多色分析以同时测量几种抗原。然而，流式细胞术在检测极其稀有的细胞群方面可能不太有效，并且在没有组织切片的情况下会丢失结构关系。流式细胞仪还具有与购买流式细胞仪相关的高资本成本。

　　蛋白质印迹

　　蛋白质印迹允许在任何纯化步骤之前或之后从细胞或组织提取物中检测特定蛋白质。蛋白质通常使用凝胶电泳按大小分离，然后通过干法、半干法或湿印迹法转移到合成膜上。然后可以使用类似于免疫组织化学的方法使用抗体探测膜，但不需要固定。检测通常使用过氧化物酶连接的抗体来催化化学发光反应。

　　Western印迹是一种常规的分子生物学方法，可用于半定量比较提取物之间的蛋白质水平。印迹之前的大小分离允许与已知的分子量标记相比，测量蛋白质分子量。

　　酶联免疫吸附测定

　　酶联免疫吸附测定或 ELISA 是一种诊断方法，用于以多孔板形式（通常每板 96 孔）从血浆、血清或细胞/组织提取物中定量或半定量测定蛋白质浓度。概括地说，溶液中的蛋白质被吸附到 ELISA 板上。对感兴趣的蛋白质特异的抗体用于探测板。通过优化封闭和洗涤方法（如 IHC）将背景降至最低，并通过阳性和阴性对照的存在确保特异性。检测方法通常是基于比色法或化学发光法。

　　免疫电子显微镜

　　电子显微镜或 EM 可用于研究组织或细胞的详细微结构。Immuno-EM 可以检测超薄组织切片中的特定蛋白质。使用透射电子显微镜可以直接观察用重金属颗粒（例如金）标记的抗体。虽然在检测蛋白质的亚细胞定位方面功能强大，但免疫 EM 在技术上可能具有挑战性、昂贵，并且需要严格优化组织固定和处理方法。提出体内蛋白质生物素化以缓解抗体染色与更好地保留细胞形态的固定方案经常不相容所引起的问题。

　　方法论概述

　　在免疫染色方法中，抗体用于检测特定的蛋白质表位。这些抗体可以是单克隆或多克隆的。可以以多种方式完成对这种第一抗体或第一抗体的检测。

　　• 可以使用酶或荧光团直接标记一抗。

　　• 可以使用与可与酶或荧光团连接的高亲和力结合配偶体相互作用的小分子标记一抗。生物素-链霉亲和素是一种常用的高亲和力相互作用。

　　• 可以使用酶或荧光团标记的更广泛的物种特异性二抗来探测一抗。

　　• 就电子显微镜而言，抗体与重金属原子相连。

　　如前所述，酶如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶通常用于催化产生有色或化学发光产物的反应。荧光分子可以使用荧光显微镜或共聚焦显微镜进行可视化。

　　免疫染色的应用

　　免疫染色的应用很多，但最常用于临床诊断和实验室研究。

　　在临床上，IHC 用于组织病理学，用于基于分子标志物诊断特定类型的癌症。

　　在实验室科学中，基于研究蛋白质的存在与否、其组织分布、其亚细胞定位以及蛋白质表达或降解的变化，免疫染色可用于多种应用。