什么是实时 PCR？

　　它是一种用于实时监测 PCR 反应进程的技术。

　　同时，可以对相对少量的 PCR 产物（DNA、cDNA 或 RNA）进行定量。

　　它基于检测报告分子产生的荧光，该报告分子随着反应的进行而增加。

　　也称为定量聚合酶链式反应（qPCR），是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的分子生物学实验室技术。

　　qPCR 是一种强大的技术，可以对 DNA 序列进行指数扩增。

　　PCR 反应需要一对与目标序列互补的引物。引物由 DNA 聚合酶延伸。

　　延伸后产生的拷贝，即所谓的扩增子，用相同的引物重新扩增，从而导致 DNA 分子的指数扩增。

　　然而，在扩增后，使用凝胶电泳分析扩增的 PCR 产物，这使得传统的 PCR 非常耗时；因为反应必须在进行 PCR 后分析之前完成。实时 PCR 克服了这个问题。

　　术语“实时”表示它可以在过程进行时监控扩增的进度，而传统的 PCR 方法只能在过程完成后进行分析。

　　实时荧光定量 PCR 原理

　　在实时 PCR 中采用了相同的 PCR 扩增原理。但不是在反应结束时查看凝胶上的条带，而是“实时”监控该过程。将反应放入实时 PCR 机器中，该机器使用相机或检测器观察反应发生。

　　尽管有许多不同的技术用于监测 PCR 反应的进程，但它们都有一个共同点。它们都将 DNA 的扩增与荧光的产生联系起来，荧光的产生可以在每个 PCR 循环期间用相机简单地检测到。因此，随着反应过程中基因拷贝数的增加，荧光也会增加，从而表明反应的进展。

　　A. 放大

　　变性

　　高温孵育用于将双链 DNA“熔化”为单链，并松散单链 DNA 中的二级结构。通常使用 DNA 聚合酶可以承受的最高温度（通常为 95°C）。如果模板 GC 含量高，可以增加变性时间。

　　退火

　　在退火过程中，互补序列有机会杂交，因此使用基于计算的引物熔解温度 (Tm) 的适当温度（低于引物 Tm 5°C）。

　　延期

　　在 70-72°C 时，DNA 聚合酶的活性是最佳的，引物延伸的速率高达每秒 100 个碱基。当实时 PCR 中的扩增子较小时，此步骤通常与使用 60°C 作为温度的退火步骤结合使用。

　　B. 检测

　　检测基于荧光技术。

　　样本首先保存在适当的井中，并像普通 PCR 一样进行热循环。

　　然而，在实时 PCR 中，机器受到钨或卤素源的影响，导致添加到样品中的标记物发出荧光，并且信号随着样品 DNA 拷贝数的扩增而被放大。

　　发射的信号经检测器检测，转换成数字信号显示在屏幕上后发送到计算机。

　　当信号达到阈值电平（检测器的最低检测电平）时，可以检测到信号。

　　实时 PCR 中使用的荧光标记

　　实时 PCR 中使用了许多不同的标记，但其中最常见的包括：

　　塔克曼探头。

　　SYBR 绿色。

　　塔克曼探头

　　它是一种水解探针，在其 5' 末端带有报告染料，通常是荧光素 (FAM)，在寡核苷酸的 3' 末端带有淬灭剂四甲基罗丹明 (TAMRA)。

　　在正常情况下，探针保持盘绕在自身上，使荧光染料靠近猝灭剂，从而抑制或猝灭染料的荧光信号。

　　Taqpolymerase 的寡核苷酸具有与靶基因同源的区域，因此当靶序列存在于混合物中时，它与样品 DNA 结合。

　　随着 taqpolymerase 在延伸阶段开始合成新的 DNA 链，它会通过 5' 末端核酸酶活性导致探针降解，荧光素与猝灭剂分离，从而产生荧光信号。

　　随着该过程的继续，在每个循环中，信号分子的数量增加，导致荧光增加，这与靶标的扩增呈正相关。

　　SYBR 绿色

　　这是一种染料，当它与 DNA 的小沟非特异性结合时会发出显着的荧光信号。

　　也可以使用其他荧光染料，如溴化乙锭或吖啶橙，但 SYBR Green 更适合使用，因为它具有更高的信号强度。

　　SYBR Green 比 Taqman 探针更受欢迎，因为它可以提供有关每个扩增循环的信息，以及无法从 Taqman 探针获得的熔解温度信息。

　　然而，它的缺点是与 Taqman Probe 相比缺乏特异性。

　　好处

　　与普通 PCR 相比，它具有许多优点：

　　它可以查看有助于确定哪些反应运作良好和哪些反应失败的反应。

　　反应效率可以精确计算。

　　反应后无需在凝胶上运行 PCR 产物，因为熔解曲线分析可以达到目的。

　　实时荧光定量 PCR 数据可用于对基因表达进行真正的定量分析。相比之下，老式 PCR 最多只能是半定量的。

　　比普通 PCR 更快。

　　sample.etc 量化的复杂性较低。

　　因此，与普通的制备型 PCR 不同，Real Time PCR 只需几个循环即可自动确定多个 PCR 反应是否成功，无需对每个反应进行单独分析，避免了“假阴性”的问题。

　　实时荧光定量 PCR 应用

　　基因表达分析

　　癌症研究

　　药物研究

　　疾病诊断与管理

　　病毒量化

　　食品检测

　　转基因食品

　　动植物育种

　　基因拷贝数