什么是免疫组织化学？

　　免疫组织化学是临床医生最喜欢的工具，可通过识别异常细胞（例如癌症细胞）来帮助诊断一系列疾病。

　　简而言之，免疫组织化学使用抗体来检测对组织切片（例如肝脏、胰腺或心脏）内的异常细胞具有特异性或在其中表达改变的蛋白质（抗原）。它也可以用作治疗结果的预测因子（例如，通过证明特定药物的靶分子的表达）。

　　在本文中，我们将概述免疫组织化学的基础知识，以帮助您快速开始使用这项技术。

　　为什么要使用免疫组织化学？

　　免疫组织化学不仅是一种有用的临床工具，而且作为一种基础研究工具也有很大的应用。它可以为您提供有关组织结构（而不是孤立的单个细胞）范围内特定蛋白质表达的大量信息。

　　这意味着您可以查看细胞内蛋白质的位置和共定位，例如在细胞核、细胞质或膜中，而细胞仍处于其“自然”环境中。

　　引起你的注意了吗？伟大的！从这里开始它只会变得更好——这不仅是一种有用的技术，而且执行起来也非常简单！

　　免疫组织化学基础：4 个主要步骤

　　准备好了解免疫组织化学基础知识了吗？一般的免疫组织化学方案包括四个主要步骤：

　　固定——让一切都在它的位置。

　　抗原修复——增加用于检测的蛋白质的可用性。

　　阻塞— 将讨厌的背景信号降至最低。

　　抗体标记和可视化——获得漂亮的图片。

　　1. 组织固定

　　这一步非常重要，因为它 保持了组织结构并保留了抗原性（抗体检测到的抗原/蛋白质的可用性）。您使用的固定方法取决于您使用的组织类型和您的个人实验要求。

　　例如，如果您想要良好的抗原表达，但又不太在意细胞的“外观”（形态），请选择速冻和丙酮固定。但是，如果形态对您来说真的很重要，请选择福尔马林固定和石蜡包埋 (FFPE) 方法。

　　2. 抗原修复

　　如果外观 是您想要的并且您选择 FFPE 方法，那么您应该考虑使用抗原修复剂进行预处理。这些通过分解福尔马林诱导的抗原交联，使抗原上的表位重新暴露于抗体结合，从而改善样品的抗原表达。

　　热和酶修复都被使用，其中热诱导表位修复 (HIER) 现在是最常用的。简单来说，HIER 涉及使用微波炉或高压锅在 pH6 或 pH9（取决于您的抗体）的缓冲液中加热载玻片。

　　您可以制作自己的缓冲液，但商业试剂也可广泛用于此目的。酶检索可能被某些人认为是过时的帽子，但仍然有它的位置。

　　您可以使用蛋白水解酶（例如胃蛋白酶或链霉蛋白酶）来分解交联并暴露您的抗体需要看到的表位；同样，一些抗体比另一种更适合一种方法。

　　3. 封锁

　　如果您曾经进行过蛋白质印迹，您就会知道染色前阻断内源性材料对于最大限度地减少假阳性染色至关重要。对于免疫组织化学，阻断时需要考虑两个主要因素。

　　阻断内源性酶

　　首先，您想要阻断或灭活组织中的内源酶，这些酶可以激活以后可能用于观察抗体结合的底物（例如内源过氧化物酶和碱性磷酸酶）。

　　过氧化物酶通常是肾脏或肝脏等组织以及存在血细胞的组织中的一个问题（可以说这在某种程度上意味着一切）。

　　碱性磷酸酶在肠道和胎盘中尤其成问题（但在 FFPE 材料中则少得多）。

　　注意内源性抗体

　　第二，注意内源性抗体，例如免疫组织中B淋巴细胞表面的抗体；二抗可能会与这些物质发生交叉反应，从而导致样品中的高背景染色。

　　仔细选择二抗可能会有所帮助，但在大多数情况下，需要通过封闭步骤来减少二抗产生的更一般的非特异性结合。不过不要担心，在每种情况下都可以使用特定的阻塞方法来改善结果。

　　4. 抗体标记和可视化

　　现在您已经完成了所有准备工作，是时候拍摄漂亮的照片了。使用免疫组织化学，可以通过以下两种方式之一进行染色： 作为间接测定或使用直接标记。

　　间接检测

　　对于间接检测，您可以使用带有共价标记的二抗。该二抗在染色过程中与一抗结合。

　　图 1.间接染色方法。

　　标准的间接检测方法 如图 1 所示 ，但本质上，以这种方式检测您的抗原有两个主要步骤：

　　在您的组织样本上孵育您的一抗（通常为 1 小时，但有时可能需要过夜孵育）。这允许抗体与抗原结合（当然假设存在抗原）。一旦结合，您需要洗去任何多余的未结合的一抗，然后再与标记的二抗一起孵育。

　　在另一个温育期（再次1小时）后，多余的二抗被洗掉，与一抗相关的标记量（即间接通过二抗）被量化。

　　直接检测

　　这种方法比间接检测更快、更简单，因为标签通过共价键直接连接到一抗上。这意味着您只需要一个孵育步骤和一轮洗涤（参见 图 2）。与间接检测相比，这种方法有几个优点，包括降低测定变异性、降低成本（通过消除对二抗的需要）和缩短时间（因为去除了第二轮孵育和洗涤步骤）。

　　图 2.直接染色方法。

　　标记样品后，就可以进行可视化了！

　　如果您使用荧光标记，则需要直接在荧光显微镜下查看您的样品——请记住根据您使用的荧光团使用适当的激发波长和滤光片组。

　　但是，如果您选择了辣根过氧化物酶等酶标签，则需要使用适当的底物进行进一步孵育。在这些情况下，酶作用于底物以产生不溶性有色成分，该成分沉积在抗体结合位点。

　　那么哪种方法最适合我？

　　尽管直接染色有明显的好处，但直接标记抗体的制备通常被认为是耗时且技术上困难的。此外，通常认为间接染色比直接染色更敏感，因为多个二抗能够与一个一抗结合，从而提高靶抗原的敏感性。

　　然而，在二抗的结合和任何洗涤步骤期间，一部分一抗将与抗原解离，因此，二抗的存在所提供的任何扩增都将显着降低。

　　本质上，您需要决定什么对您更有利。如果时间至关重要，并且非特异性结合在您的免疫组织化学实验中一直存在问题，那么有一些可用选项可让您快速直接标记一抗，而无需任何技术专业知识。