流式细胞仪是一个数字游戏。有人口百分比、荧光强度测量、样本平均值、数据标准化等。许多这些常见的计算是有用的，但被误解所包围。本入门书将帮助您决定使用哪种计算、何时使用以及如何解释结果。

　　1.染色指数

　　染色指数 (SI) 是一种测量荧光染料相对亮度并以生物学相关方式将其与其他荧光染料进行比较的方法。

　　SI 可用于对您选择的仪器上的荧光染料亮度进行排名。它也是评估滴定数据的有用工具。

　　SI 是一个相对数字，所以最好关注比较，而不是绝对值。

　　在决定哪种荧光染料比另一种更亮的情况下，Biolegend有这样的网站，BD有这样的网站，它们根据标准分析给出相对排名。这些很有用，但如果您的系统与标准显着不同，您可能会从自己执行实验中受益。

　　SI 首次在 Bigos 细胞计数摘要中报道，并由Maecker 等人推广。SI 的初始概念是一种比较和排列不同荧光染料的方法，以帮助研究人员决定这些不同荧光染料的相对亮度，如下所示（图 1）。

　　图 1.染色指数的示意图和公式。

　　简而言之，距离是正数的平均值（在经典定义中）减去负数的集中趋势之间的差值。这除以标准偏差所测量的底片传播的两倍。

　　SI 有多种用途。最值得注意的是染色指数图表的生成，如表1所示。通过计算每种荧光染料的相对亮度，您可以获得一个工具来帮助您决定在面板构建过程中使用哪些荧光染料。

　　在表 1 中， LSR-12A 是 3 激光（405、488 和 633 nm）系统，而 LSR-18A 是 4 激光（405、488、532 和 633 nm）系统。

　　表 1：比较两种不同仪器的染色指数。

　　注意相对排名的差异。有些很容易解释。例如，由于 532 激光器的存在，AF532 在 LSR-18A 上比在 LSR-12A 上相对更亮。

　　其他差异与这些不同仪器的灵敏度和背景有关。例如，APC（被认为相对较亮）不如任一仪器上的 FITC 信号亮。这两台机器上的背景荧光和扩散推动了这一观察。

　　SI 的另一个用途是在滴定数据中确定最佳浓度。虽然它通常是通过肉眼完成的，但绘制数据可以提高计算的可视化（图 2）。

　　图 2：使用染色指数对浓度的滴定数据。

　　染色指数是一种有用的计算方法，应该包含在您的流式细胞仪工具包中。

　　作为说明，Telford 和同事发表了染色指数的变体。

　　并排运行这些方程后，我还没有看到有什么不同，所以选择你最熟悉的一个并使用它。

　　2. 数据规范化

　　有时，需要对数据进行规范化。该过程通常涉及确定适当的对照群体并将实验除以对照。

　　背景计算的简单折叠可以像 % 阳性/% 对照细胞一样简单，以产生可用于统计分析的单个指标。

　　对于基于表达式的计算，建议使用分辨率度量 (R D )。

　　该指标基于 Fisher 判别比。使用该等式，可以通过标准偏差的总和来测量和校正两个总体之间的差异。基本公式如下所示：

　　使用此公式，可以将在不同日期进行的测量转换为更适合比较的单个无单位数字。这种计算已经在基因组学分析中使用了一段时间，并且在流式细胞术中也越来越普遍。

　　3.统计计算

　　您需要使用多种统计工具来汇总数据并评估实验旨在检验的假设。归根结底，有一堆数字需要进行适当的分析。

　　如果实验计划布置得当，统计分析方法也已经布置好了。

　　在这篇文章中，每种不同方法背后的实用数学都不是值得担心的。那里有很棒的软件包可以为您进行计算。

　　但是，在讨论统计计算时要注意几件事是很重要的。

　　选择正确的测试——您需要根据您要证明的内容选择正确的统计测试。这些可能是 t 检验、方差分析、线性回归或基于数据分布和进行比较的其他少数检验之一。

　　设置适当的阈值- α 值是用于确定您的数据是否符合拒绝原假设的标准的阈值。如果计算的 P 值小于阈值，则认为实验具有统计显着性（您拒绝原假设）。如果 P 值大于阈值，则不能拒绝原假设。当然，重要的是要记住，实验旨在测试的问题很重要并且具有生物学相关性。在某些情况下发现了意义，但这个问题在科学上是微不足道的。确保在开头陈述假设并坚持到结尾。

　　收集足够的样本— 您不想与像这两个家伙这样的生物统计学家进行讨论— 功效计算可以帮助您确定应该收集的样本数量以正确分析您的实验。

　　4. 排序计算

　　细胞分选是从系统中的背景细胞中分离出感兴趣的细胞的强大工具。

　　从简单的 GFP+ 分选到复杂的多色面板来分离罕见的循环肿瘤细胞，分选背后有很多数学问题，而不仅仅是为了让系统正常工作。这里有一些计算可以帮助您回答最常见的排序问题。

　　我可以多快排序？

　　一旦您意识到细胞分选器正在分选液滴，事情就开始变得容易一些。使用静电细胞分选机，目标是在一个液滴中包含一个细胞，而在周围的液滴中没有细胞。

　　这个过程由泊松统计控制。

　　正如纪念斯隆凯特琳 (Memorial Sloan Kettering) 流式细胞术负责人 Rui Gardner 的这张图所示，每 4 滴有 1 个细胞为您提供了在领先或落后滴中没有细胞的合理概率。

　　因此，下降驱动频率除以 4 的简单计算将为您提供您应该在分拣机上争取的最大事件率。

　　我需要从多少个细胞开始？ 需要花多长时间？

　　从下游应用程序所需的单元数开始，可以估计从多少个单元开始，以便最终获得足够的单元。同时，我们可以估计运行需要多长时间，除非出现不可预见的情况。

　　需要的总细胞数 /（种群频率 * 分类效率）= 起始种群我喜欢将起始种群加倍以解决处理过程中的损失。

　　起始人口/最大事件/秒 = 排序时间（秒）

　　我的样品纯度如何？我的排序后恢复是什么？

　　以下是可用于表征排序的三个常用值。

　　有了这些信息，您就可以计算出您的排序需要多长时间，因此您可以做出相应的计划。您还可以观察排序的好坏以及是否有足够的细胞用于下游应用。

　　5. 补偿

　　如果不涉及流式细胞术中最基本的计算——补偿矩阵的计算，任何关于流式细胞术计算的帖子都是不完整的。

　　comp 矩阵对于良好的流式细胞术至关重要，以便正确考虑从给定荧光染料到辅助通道的光谱重叠，以确保可以识别真实信号。

　　提醒一下，这 3 条规则是：

　　补偿样品应至少与将应用补偿的实验样品一样亮。

　　阴性和载体的背景必须匹配（没有通用阴性；细胞对细胞，珠对珠）。

　　补偿色必须与实验色相匹配。

　　相同的荧光染料（FITC ≠ A488，串联必须来自完全相同的库存）。

　　相同的灵敏度（不要改变管之间的电压）。

　　并且一如既往地收集足够的事件。遵循这些规则将确保您获得一致和正确的补偿。

　　如果您尚未将这些计算集成到您的工作流程中，请考虑每种计算的用处。有些，如 SI，在新面板的开发中非常有用——从滴定到电压，它使不同样品的比较变得容易。虽然可以绘制数据并尝试用肉眼衡量，但有一个数字更容易做出决定。在准备排序时，进行这些计算至关重要，即使对于您可能需要从多少个单元格开始计算也是如此。

　　补偿当然是最关键的计算之一，因此请确保您提供符合“3 条规则”的正确控制，并让软件完成工作。最后，进行这些计算应该有助于您的工作，因为它将提高一致性和可重复性，并确保您有足够的细胞用于下游应用。