流式细胞仪数据分析通常涉及一个步骤，其中定义了一系列门以识别感兴趣的人群。

　　强大的门控策略的开发以及这些策略的沟通可能很复杂。论文中的数字通常只讲述了故事的一部分。在多中心研究领域和需要提高可重复性的情况下，了解每个门控策略的细节至关重要。

　　正如 Maecker 等人在本文中指出的那样，由于数据分析导致的变异系数从在单个实验室执行时的 20.5% 下降到集中执行时的 4%。随着 FlowRepository 的发展，调查人员现在可以访问存储的数据，并使用原始数据完成已发布的分析。该资源将继续提高共享和交流通常很复杂的门控策略的能力。

　　在培训新用户进行数据分析时，您应该将几种不同的最佳实践和门控策略纳入您的分析中。您还必须了解一些误解。例如，太多的研究人员依赖于简单的前向散射 (FSC) 旁散射 (SSC) 门来开始他们的分析。

　　通常，此基本门仅适用于高级数据缩减，例如移除位于轴下边缘的碎片，而不适用于定义整个起始人口。相反，您应该依赖针对特定细胞类型的抗体（例如 CD45，如果您的目标是对淋巴细胞进行门控）作为您的“起始”门控，而不是仅根据 FSC x SSC 门控来定义您的细胞。这将导致更准确的统计分析和更好的总体结论。

　　您应该使用的 3 个流式细胞术门

　　许多研究人员没有使用 3 个门，但在分析他们的流式细胞仪数据时应该使用。

　　这些门对于良好的数据分析至关重要。它们将有助于消除许多可能使您的分析蒙上阴影的混淆事件，尤其是在涉及罕见事件的情况下。

　　1.“单身”之门。

　　正确的流式细胞仪数据分析需要单细胞。 细胞团块，除了在非常特殊的分析中，可能会导致下游的重大问题。同样，同时发生的事件（两个细胞通过截距太快以至于脉冲无法分离）可能会混淆您的分析。因此，已经开发了许多不同的方法来去除代表细胞团块的同时发生的事件。

　　首先，重要的是可视化和了解流式细胞仪检测器发出的电子脉冲的形状。

　　如上图所示，脉冲由三个分量组成——脉冲高度 (-H)、脉冲宽度 (-W) 以及称为脉冲面积 (-A) 的高度和宽度的积分。对于数字流式细胞仪，脉冲区域通常用于测量和报告荧光。  这是因为脉冲面积是对细胞荧光的更准确测量。

　　但是当两个细胞要么粘在一起要么太靠近通过截取点时，这个脉冲会发生什么？

　　在这里，很明显有两件事发生了变化——脉冲面积和脉冲宽度。如上图所示，与单细胞相比，脉冲面积和脉冲宽度都变大了。您可以利用此更改创建一个门，以消除显示脉冲面积增加而不增加脉冲高度的单元格。

　　如下图所示，沿对角线的单元是要进行门控的单个单元。该对角线以外的单元格应从数据中排除。对于此门，请使用 FSC 区域 (FSC-A) 的 FSC 高度 (FSC-H)。也可以使用 SSC-A 的 SSC-H。

　　重要的是要记住在收集数据之前打开流式细胞仪软件包中的 -H 参数，以便将其包含在 FCS 数据文件中。

　　2.“时间”之门。

　　细胞通过激光拦截的顺序是 FCS 文件的组成部分。因此，可以将时间用作门控参数来帮助“清理”数据。应该将时间门添加到您的数据分析工作流程中的原因有很多。

　　如果没有建立稳定的流动（或细胞流动），则无法进行良好的流式细胞术。是的，FCS数据文件中会有数据，但是数据的质量会有问题。通过时间图可视化细胞流动的情况将揭示流动问题，例如细胞流动不稳定（见下图）。

　　可以通过时间门控将流动不良的区域排除在流动良好的区域之外（分别参见下图中的左侧门与右侧门），这将确保更高质量的数据。

　　可能会发生堵塞。可能会发生背压。管子可以干涸。这些问题可能会导致数据采集出现问题，通常会影响流速，并表现为数据丢失。绘制数据与时间的关系图将帮助您识别这些问题，并允许您从下游分析中删除有问题的事件（见下图）。

　　3.“生存力和倾销”之门。

　　良好的面板设计包括活性染料和转储通道。这两个标记用相同的荧光染料标记（或至少占据相同的通道），用于减少分析中不感兴趣的细胞。

　　活力染料有助于消除正在死亡的细胞，这很重要，因为这些细胞会影响您的结果。另一方面，转储通道包含那些针对下游分析不感兴趣的细胞的抗体。通过可视化您的活力染料与转储通道，您将能够准确地选择您感兴趣的“活”细胞（见下图）。

　　创建转储门的一种简单方法是使用一组生物素化抗体和您选择的荧光染料的链霉亲和素偶联物。如果您想稍后对细胞进行分类，此策略可为您进行磁珠耗尽测定。

　　总之，上述 3 个门将导致以下门控策略：

　　在您的分析中添加单项、时间和可行性和转储门将通过删除不属于您感兴趣的群体的细胞来提高结果的准确性。通过激活流式细胞仪软件包中的高度值，您将能够绘制准确的单门。通过查看时间与细胞流动的关系，您将能够评估细胞仪在收集运行期间是否正确运行。通过使用可行性和倾倒门，您将确保您只关注您感兴趣的“活”人口。在流式细胞术实验中使用和交流这些门将有助于提高流式细胞术数据分析整个领域的一致性和可重复性。