流式细胞仪分析通常从创建门以区分感兴趣的细胞开始。对于流式细胞仪新手来说，这个门控过程可能看起来非常随机，但实际上它是流式细胞仪分析中最重要的部分。

　　那么，您需要了解哪些门控方法才能自信地分析染色样品？这篇博文将带您了解有效流式细胞术分析的各种门控策略。

　　尽可能多地了解您感兴趣的细胞

　　您的门控策略取决于您对感兴趣细胞的了解。因此，在您开始分析之前，首先要尽可能多地了解您正在分析的细胞。要确定的是细胞特异性标志物的相对表达水平、细胞的大致大小以及它们的大小是否会受到实验条件的影响。例如，细胞内染色过程中的固定和透化过程可以改变细胞大小和粒度，导致修改前向和侧向散射曲线（下文讨论）。如果您之前没有使用感兴趣的细胞的经验，请务必查阅文献作为指导。在开始之前，您还应该确保包含适当的控制以进行准确的数据分析。我们最近流式细胞仪控制网络研讨会提供了有关在您的实验中包含哪些控制的信息。

　　前向和侧向散射密度图，用于识别您感兴趣的细胞群并排除碎片

　　前向与侧向散射（FSC 与 SSC）门控通常用于根据大小和粒度（复杂性）识别感兴趣的细胞。通常建议前向散射表示细胞大小，而侧向散射与细胞的复杂性或粒度有关。但是，应该注意的是，前向散射不一定与大小有关，侧向散射并不是真正的粒度。虽然这些是基于光折射的指示，但它取决于样品、鞘液和激光波长。例如，FSC 与 SSC 门控对血液样本最有用，但即便如此，粒细胞 (12-17 μm) 有时会显得比单核细胞 (20-25 μm) 大。此外，对于小样本，光散射水平并不总是与大小相关。

　　尽管有这些警告，但在具有多种细胞类型的样本中，这种第一级门控方法对于识别感兴趣的细胞很有用。图 1 显示了如何使用 FSC 与 SSC 门控来识别红细胞裂解全血中的不同细胞类型。

　　这种门控策略也可用于排除碎片，因为它们往往具有较低的前向散射水平。它们通常位于 FSC 与 SSC 密度图的左下角（图 2）。

　　门控时，请记住爆破细胞可能比静止细胞大；因此，严格的门可能意味着您错过了对您的实验很重要的人群。在这种情况下，使用活性染料去除碎片和死细胞可能是有用的，就像背栅（下面讨论）一样，可以识别落在门外的细胞。此外，对于血液或骨髓等某些样本，对 SSC 与 CD45 或其他标记进行门控可能有助于识别您需要的细胞。

　　从本质上讲，重要的是要处理数据并检查所有内容，因为您的单元格可能不在您认为的位置。

　　图 1.红细胞裂解全血的正向和侧向散点图

　　图 2.排除碎片的前向和侧向散点图

　　双峰排除的前向散射高度与前向散射面积密度图

　　双重细胞会显着影响您的分析，并可能导致不准确的结论。前向散射高度 (FSC-H) 与前向散射面积 (FSC-A) 密度图可用于排除双峰，如下图 3 所示。也可以使用侧向散射高度 (SSC-H) 与侧向散射面积 (SSC-A) 的关系图。由于 FSC 检测器通常不是光电倍增管 ( PMT )，因此这种类型的门控对于双重排除可能更敏感。

　　图 3.双峰的 FSC-H 与 FSC-A 图

　　用于识别具有特定标记表达的细胞的单参数直方图

　　单参数直方图可用于进一步识别在特定细胞群中表达特定标记的不同细胞类型。例如，在对红细胞裂解全血上的淋巴细胞进行门控后（图 1），可以生成 CD3 单参数直方图来识别 CD3 表达细胞（图 4）。此外，这种类型的图还可用于轻松排除死细胞。如果细胞用碘化丙啶或7-AAD等活性染料染色，则可以使用单个参数直方图来识别对染料呈阳性的死细胞。

　　图 4.使用先前对淋巴细胞群进行门控的红细胞裂解全血的单参数直方图

　　用于进一步分析的两个参数密度图

　　两个参数密度图，其中每个轴代表您的样品已染色的特定标记，可用于进一步分析您的样品。例如，如图 1 所示，在对全血的淋巴细胞门进行门控后，可使用双参数密度印迹通过在 CD3 与 CD19 上创建图来区分 T 细胞和 B 细胞（图 5）。

　　图 5.用 CD3 ( MCA463A647 ) 和 CD19 ( MCA1940PE ) 染色的红细胞裂解全血的二参数密度印迹

　　后门

　　Backgating 是确认染色模式或门控方法的常用方法。如果您不确定您的门、表达水平或您的细胞，或者您的分析中是否包含死细胞，这对于获取更多信息以识别您的细胞很有用。

　　使用上述门控方法，您现在应该能够自信地分析您的细胞并根据您的流式细胞术分析得出准确的结论。