细胞冻存，是指将细胞贮存在超低温环境中，使细胞暂时“冬眠”的技术，在需要的时候再进行复苏。

　　细胞复苏，是把冻存在-80℃冰箱或液氮中的细胞快速解冻，并使细胞重新恢复生长的技术。

　　细胞冻存篇

　　冻存原则

　　细胞冻存原则为“慢冻”，即让细胞在缓慢降温的条件下逐渐冷冻。

　　如果直接将细胞悬液放在超低温下快速冷冻，细胞会受到冷冻损伤而死亡。在冻存液中添加的保护剂（如DMSO、甘油）和在冻存盒中添加的异丙醇，都起到程序性降温的作用。

　　DMSO使用注意事项

　　DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，延缓温度下降速度，减少细胞内冰晶的形成，从而起到保护细胞的作用。

　　需注意的是，DMSO溶于培养基时，将释放大量热量，所以细胞冻存液需提前配制，不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中，避免烫伤细胞。

　　另外，DMSO属于致癌物质，使用时应戴好手套，规范操作。

　　程序冻存液配方

　　程序冻存液成分一般由基础培养基、胎牛血清、DMSO组成。血清比例为10%~90%，DMSO比例为5%~10%。根据普诺赛实验室细胞培养经验，推荐冻存液配比：55%基础培养基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，难养细胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO冻存。

　　细胞冻存密度

　　细胞冻存和复苏过程中，不可避免会损失部分细胞，所以冻存的密度不能太低。提高冻存密度有助于提升细胞复苏存活率，推荐密度为100~300万细胞/mL。

　　冻存操作方法

　　方法一：使用程序冻存盒

　　使用程序降温盒是最常用的冻存方法。市面上的降温盒有些需要添加异丙醇，有些则不需要。

　　降温盒须恢复室温后再使用。

　　根据普诺赛实验室细胞培养经验，使用程序冻存盒冻存效果良好，没有冻存盒的同学可以参照下文方法二和方法三。

　　操作步骤

　　步骤1：配制程序冻存液，放在室温备用或放在4℃预冷

　　步骤2：离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1200rpm或250g，时间3min）

　　步骤3：用配制好的冻存液重悬细胞，按照1~1.5mL/管分装到冻存管中，拧紧管盖，做好标记

　　步骤4：冻存管放入冻存盒，冻存盒放入-80℃冰箱过夜（24h）

　　步骤5：冻存管从冻存盒取出，转移至液氮长期保存

▲ 使用冻存盒操作示意图

　　方法二：使用无血清非程序冻存液

　　无血清非程序冻存液是一种商品化的冻存液，无需自己配制，无需降温盒，大大提升了便捷性。

　　但是，并非所有细胞都适用于这种冻存液，使用前必须做冻存测试，没问题后再批量应用。

　　操作步骤

　　步骤1：从冰箱拿出无血清非程序冻存液，待用

　　步骤2：离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1200rpm或250g，时间3min）

　　步骤3：弃上清，加入适量无血清非程序冻存液，重悬细胞

　　步骤4：按照1~1.5mL/管的量分装到冻存管中，拧紧管盖，做好标记

　　步骤5：将冻存管直接移入-80℃冰箱中，24h后转移至液氮长期保存

▲ 使用无血清非程序冻存液操作示意图

　　方法三：手动梯度降温

　　在没有冻存盒或者非程序冻存液时，可以选择手动梯度降温。但手动梯度降温不适用于所有细胞，且效果不稳定，同样需要先做冻存测试。

　　操作步骤

　　步骤1：配制程序冻存液，放在室温备用或放在4℃预冷

　　步骤2：离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1200rpm或250g，时间3min）

　　步骤3：用配制好的冻存液重悬细胞，按照1~1.5mL/管分装到冻存管中，拧紧管盖，做好标记

　　步骤4：冻存管按照【4℃（20min）→-20℃（30min）→-80℃（24h）→液氮】的顺序放置

▲ 手动梯度降温操作示意图

　　细胞复苏篇

　　细胞复苏讲究“快融”，越快融化，细胞所受损伤就越小。细胞复苏的操作不复杂，但每一步都必须稳扎稳打，才能最大限度地提高复苏存活率。

　　细胞复苏步骤

　　步骤1：水浴锅预热至37℃备用

　　步骤2：准备15mL离心管，并向其中加入适量培养基待用

　　（小贴士：离心管中加入2~9mL的培养基，比较难养的细胞，可适量增加培养基。）

　　步骤3：将细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入水浴锅

　　（小贴士：如果冰箱或液氮距离水浴锅路途较远（步行超过1min），要把细胞先置于干冰上，再送至水浴锅。如果将细胞冻存管直接放在手上或口袋里，可能导致温度逐渐回升而产生冰晶损伤细胞。而将细胞冻存管装在PE手套中，是为了预防污染。）

　　步骤4：用力摇晃冻存管，使其在1分钟内融化

　　（小贴士：这一步越快融化越好，最好能放计时器在旁边。如果1分钟内没有融化，可能是冻存液量偏多，或者摇晃力度不够。）

　　步骤5：用纸巾擦拭水渍，转移至生物安全柜。用移液枪吸取细胞悬液，缓慢滴加到步骤2中准备好的离心管

　　（小贴士：当同时复苏多管细胞时，注意不要弄混。）

　　步骤6：1200rpm离心3分钟

　　（小贴士：离心是为了去除DMSO，对于DMSO敏感的细胞，必须离心；若复苏的细胞对DMSO不敏感，步骤6、步骤7可以省略，直接将培养基补足至10mL，接种至培养器皿中，第二天换液。）

　　步骤7：弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，接种至新的无菌培养器皿中

▲ 细胞复苏操作示意图

　　做完步骤7，细胞就复苏好了。复苏的细胞需要一段时间恢复状态，当复苏后的细胞密度低于80%时，48小时内不要换液，待细胞形态、生长速度等恢复正常，再进行细胞传代等操作。（不要因为复苏后两三天细胞状态不好就丢弃，应耐心等待至少一周。）

　　当然，细胞复苏后状态很好的情况下，可以提前开始后续的细胞培养实验。