这篇文章由客座博主Luke Lavis贡献，他是霍华德休斯医学研究所 Janelia 研究园区的组长。

　　绿色荧光蛋白 (GFP)的发现引发了生物成像的复兴。突然之间，细胞生物学家不再受制于化学家和（昂贵的）合成荧光团。添加一点带有电震动的 DNA，细胞就会完全能够自行合成荧光团融合。荧光蛋白的后续进展复制了许多曾经专属于小分子的特性：红移光谱、离子敏感性、光活化等。这些令人印象深刻的进展引出了一个明显的问题：在这个 GFP 及其同类的时代，为什么要细胞生物学家与化学家交谈？

　　一个原因是所谓的“光子预算”：每个样品都有有限数量的荧光团，并且每个荧光团在漂白之前可以发射有限数量的光子。可以从生物样本中提取的信息量完全取决于光子预算，推动荧光显微镜的前沿通常需要更多的光子。例如，从蛋白质融合的瞬时过表达转移到基因编辑细胞可以减少荧光团的数量，从而影响光子预算。同样，从整体成像到单分子成像的转变给光子预算带来了更大的负担，这决定了我们可以跟踪单个分子的时间和精度。

　　化学荧光团比荧光蛋白更亮，更耐光，提供了一种直接改善光子预算的方法。当然，“恢复”为小分子染料似乎令人生畏——没有人愿意花时间将荧光结合物显微注射到细胞中。幸运的是，在过去的 20 年里，聪明的化学家和生物化学家已经开发出技术，使标记化学在复杂的生物环境（如活细胞和组织）中更容易和更有效（图 1）。这些灵活的策略为您提供两全其美的优势：化学染料的出色光物理学与荧光蛋白的易用性和特异性相结合。

　　细胞内标记策略

　　大多数细胞内标记策略有两个部分：(1) 基因编码的“标签”，表示为与您最喜欢的蛋白质的融合；(2) 与标签结合的合成荧光团“配体”。与生物成像中的大多数好想法一样，细胞内标记技术的最初突破是由Roger Tsien提供的，他表明双胨染料配体（例如 FlAsH、ReAsH）和短基因编码的四半胱氨酸（Cys 4 ) 肽标签可用于标记细胞中的蛋白质（图 1a）。基于此概念开发的其他策略包括：

　　自标记标签（例如，SNAP-tag、HaloTag、TMP-tag）——这些广泛使用的系统由基因编码的酶变体标签组成，该标签与附着在荧光团上的小底物配体基序发生特异性且不可逆的反应（图 1b）。

　　工程连接酶（例如硫辛酸连接酶、生物素连接酶、磷酸泛酰氨基转移酶）——这些酶催化荧光团配体与肽标签的共价连接（图 1c）。

　　点击化学（例如，反式环辛烯-四嗪） ——非天然氨基酸可以掺入蛋白质结构中，然后与不断增长的生物正交化学反应工具箱（即点击化学）一起使用，在特定的掺入位点附着荧光团（图 1d ）。

　　荧光激活蛋白 (FAP) ——这些修饰的抗体片段结合并增强小分子荧光（图 1e）。

　　污渍——这些标签由与对内源性分子靶标（如紫杉醇）具有高亲和力的分子物质结合的荧光团组成。与其他系统不同，不需要基因编码标签，因为小分子结合基序靶向内源蛋白（图 1f）。

　　标签策略的优缺点

　　所有这些标记策略都在基因编码标签的大小、荧光团附着的速度和选择性、所得结合物的亮度以及系统的复杂性之间进行权衡。小分子标记策略的一个特别理想的特性是荧光性，这意味着配体在溶液中游离时表现出低荧光，但在与其同源蛋白结合时表现出高荧光。在某些情况下，这种特性消除了从样品中去除多余染料的需要，这对于难以清洗的样品（例如完整组织）尤其重要。一些化学标记策略，如双胂染料（图 1a）和 FAP 系统（图 1e）本质上是荧光的，而其他一些化学标记策略可以使用对环境敏感的荧光团产生荧光。总体而言，考虑到系统的相对简单性和荧光和荧光配体的可用性，自标记标签系统（图 1b）可能是活细胞标记的最佳方法，也是从荧光蛋白转换的最简单方法。

　　新的荧光团

　　作为这些创新标记策略的必然结果，包括我在内的几个小组一直在重新审视染料的旧化学方法。1856 年，威廉·珀金 ( William Perkin ) 发现了第一种合成染料紫红色。他的发现引发了一系列活动，大多数经典的小分子荧光团，如罗丹明（图 2a），都是在 19世纪世纪。由于其成熟的化学性质、小尺寸、亮度和细胞渗透性，许多小分子标记技术都集中在这种经典的、中性的染料支架上。在过去的几十年中，对这种已建立的染料结构的进一步改进已经产生了先进的罗丹明荧光团的商业面板，例如 Alexa Fluor 和 ATTO 染料，具有改进的亮度、光稳定性和光谱范围。然而，这些荧光团被设计为用于固定细胞成像的抗体和寡核苷酸标记，而不是用于活细胞应用。因此，这些荧光团通常体积庞大且含有极性基团（图 2b），这可能会妨碍它们在活细胞内的使用。我们最近发现，加入四元氮杂环丁烷环可以显着提高经典罗丹明及其类似物的亮度和光稳定性，而不会牺牲它们的小尺寸和膜渗透性（图 2c）。这些细胞透Janelia Fluor (JF) 染料在活细胞内具有优异的性能，尤其适用于高级成像实验。我们继续开发具有不同光谱特性、具有高荧光性、可光活化和在体内发挥作用的衍生物。

　　最后的想法

　　荧光蛋白的易用性和持续改进使其成为许多（如果不是大多数）荧光显微镜实验的首选。但是，当您的预算变得有点少时，小分子标记方法可以为您的成像实验提供新的光子注入。创新的标记策略和改进的荧光团使化学染料对细胞生物学家越来越有吸引力和可及——而我们还没有完成。对这些系统的进一步改进——更小的标签、更亮的共轭物、更高的荧光性、光活化等——可以进一步增加光子预算，让我们能够进一步推动生物成像的前沿。